Method Article

מיקרוסקופ זמן-lapse מיקרופלואידית לחקר התמדה אנטיביוטית בחיידקים

October 30th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Oms, T., et al. ניתוח אוכלוסייה ותאים בודדים של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מציג פרוטוקול לניטור תאי חיידקים בודדים המבטאים חלבון קושר DNA בעל תווית פלואורסצנטית בתוך מערכת מיקרופלואידית. הוא ממחיש כיצד אנטיביוטיקה מעכבת את רוב התאים, בעוד שתת-אוכלוסייה של תאים מתמידים שורדת את הטיפול וגדלה מחדש לאחר הסרת האנטיביוטיקה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית מיקרוסקופיה מיקרופלואידית בהילוך מהיר

הערה: הסעיף הבא מתאר את הכנת הצלחת המיקרופלואידית וכן את הליך רכישת התמונות וניתוח התמונה בזמן-lapse. מטרת ניסוי זה היא להתבונן ולנתח את פנוטיפ ההתמדה לאחר טיפול אנטיביוטי ברמת התא הבודד. הנתונים שנאספו במהלך ניסוי זה יכולים לשמש ליצירת מגוון רחב של תוצאות בהתאם לשאלה שטופלה ו/או המדווחים הפלואורסצנטיים ששימשו במהלך הניסוי. בניסוי המתואר כאן, בוצע ניתוח כמותי של אורך התא והפלואורסצנציה של HU-mCherry המשקף את ארגון הנוקלואידים בתאים מתמידים ולא מתמידים.

  1. תרבית תאי חיידקים למיקרוסקופ זמן-lapse מיקרופלואידית
    1. יש לחסן 5 מ"ל של מדיום (3-[N-morpholino] חומצה פרופנסולפונית (MOPS) גליצרול 0.4%, בתוספת אנטיביוטיקה סלקטיבית במידת הצורך) עם מושבה מבודדת בצינור זכוכית (≥25 מ"ל), ולהניח את הצינור באינקובטור רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך הלילה (בין 15 שעות ל-19 שעות).
    2. למחרת, מדוד את ה-OD600 ננומטר, ודלל את התרבית במדיום טרי מותאם לטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס, MOPS גליצרול 0.4%) בצינור זכוכית ל-OD סופי של600 ננומטר של ~0.001. תנו לתרבית לגדול בן לילה (בין 15 שעות ל-19 שעות) באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד כדי לקבל תרבית בשלב אקספוננציאלי מוקדם למחרת.
  2. הכנת הצלחת המיקרופלואידית והדמיית מיקרוסקופ זמן-lapse
    הערה: ניתן לבצע ניסויים מיקרופלואידיים במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית (כמתואר כאן) או במערכות מיקרופלואידיות המיוצרות בבית.
    1. הסר את תמיסת השימור (אם קיימת) מכל באר של הצלחת המיקרופלואידית, והחלף אותה במצע תרבית טרי.
      הערה: אם הצלחת המיקרופלואידית מכילה באר יציאת פסולת, יש להסיר את תמיסת השימור של באר היציאה אך לא להחליף אותה במדיום.
    2. אטום את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת הסעפת על ידי לחיצה על כפתור האיטום או דרך התוכנה המיקרופלואידית (בחר תחילה כלי, ואחריו לוחית איטום).
      הערה: כדי לאטום את הצלחת, יש להפעיל לחץ אחיד על הצלחת ועל הסעפת על ידי לחיצה ידנית של הצלחת על הסעפת. אם מבוצע כהלכה, הפתק "אטום" אמור להופיע בממשק ONIX2. חשוב לא להפעיל לחץ על מגלשת הזכוכית כדי למנוע כל סיכון פוטנציאלי לשבירת הסעפת.
    3. לאחר האיטום, בצע רצף תחול ראשון (לחץ על הפעל רצף תחול נוזלי בממשק התוכנה המיקרופלואידי).
      הערה: הפעל רצף תחול נוזלי מתאים ל-5 דקות של זלוף ב-6.9 kPa עבור בארות 1-5, ואחריו 5 דקות של זלוף ב-6.9 kPa עבור באר 8, וסבב זלוף אחרון לבאר 6 למשך 5 דקות ב-6.9 kPa. רצף ה-Run Liquid Priming מאפשר להסיר את תמיסת השימור שעשויה עדיין להיות קיימת בתעלות המחברות בין הבארות השונות.
    4. דגרו את הצלחת בארון מבוקר תרמוסטטי של המיקרוסקופ בטמפרטורה הרצויה (כאן, 37 מעלות צלזיוס) למשך שעתיים לפחות לפני תחילת הדמיית המיקרוסקופיה.
    5. התחל רצף התחלה נוזלי שני לפני תחילת הניסוי.
    6. אטום את הצלחת המיקרופלואידית על ידי לחיצה על אטם בממשק התוכנה המיקרופלואידית. החלף את המדיום בבאר 1 ובבאר 2 ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי, בבאר 3 ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי המכיל את האנטיביוטיקה (כאן, אופלוקסצין (OFX) ב-5 מיקרוגרם ·מ"ל-1), בבאר 4 ובבאר 5 ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי, בבאר 6 עם 200 מיקרוליטר של מדיום טרי, ובבאר 8 עם 200 מיקרוליטר של דגימת התרבית (משלב 1.2) מדולל ל-OD600 ננומטר של 0.01 במדיום הטרי.
    7. אטום את הצלחת המיקרופלואידית כמתואר בשלב 2.2 והנח אותה על מטרת המיקרוסקופ בתוך ארון המיקרוסקופ.
      הערה: הקפד להניח טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ לפני הנחת הצלחת המיקרופלואידית.
    8. בתוכנה המיקרופלואידית, לחץ על טעינת תאים כדי לאפשר את טעינת התא לתוך הצלחת המיקרופלואידית.
      הערה: שלב טעינת התאים כולל 15 שניות של זלוף ב-13.8 kPa עבור באר 8, ואחריו 15 שניות של זלוף ב-27.6 kPa עבור באר 6 ובאר 8, וסבב זלוף אחרון לבאר 6 למשך 30 שניות ב-6.9 kPa. צפיפות התאים בצלחת המיקרופלואידית היא קריטית לניסוי. החלק הראשון של פרוטוקול מיקרופלואידיקה זה מורכב מגידול חיידקים במשך 6 שעות במדיום טרי לפני הטיפול האנטיביוטי. לאחר 6 שעות של גדילה, צפיפות התאים צריכה להיות מספיקה כדי לזהות את התאים המתמידים הנדירים (בתנאים ששימשו במחקר זה, התאים המתמידים מייצרים בתדר של 10-4). אם צפיפות התאים גבוהה מדי, קשה להבחין בין התאים הבודדים, מה שמונע ניתוח מדויק של תא בודד. מכיוון שקצב הגידול תלוי ישירות במדיום, יש להעריך את צפיפות התאים בשדות המיקרוסקופיה לפני השקת הניסוי.
    9. הגדר מיקוד אופטימלי באמצעות מצב אור משודר, ובחר מספר אזורי עניין (ROI) שבהם נצפה מספר תא מתאים (עד 300 תאים לשדה).
      הערה: בחר לפחות 40 החזר ROI כדי לוודא שהתאים המתמידים הנדירים מצולמים.
    10. בתוכנה המיקרופלואידית, לחץ על צור פרוטוקול. תכנת את הזרקת המדיום הטרי ב-6.9 kPa למשך 6 שעות (באר 1-2), ולאחר מכן הזרקת המדיום המכיל את האנטיביוטיקה ב-6.9 kPa למשך 6 שעות (באר 3), ולבסוף, הזרקת מדיום טרי ב-6.9 kPa למשך 20 שעות (בארות 4-5).
      הערה: תרבית חיידקים מדוללת ל-OD600 ננומטר של 0.01 מאפשרת לחיידקים לגדול בתא המיקרופלואידי למשך 6 שעות, מה שמבטיח שהתאים נמצאים בשלב הצמיחה האקספוננציאלי. בהתאם למספר התאים שהוכנסו למכשיר המיקרופלואידי במהלך שלב הטעינה (ראה שלב 2.8), ניתן להתאים את משך שלב הגידול כדי להשיג עד 300 תאים לכל החזר ROI. מכיוון שהתמדה היא תופעה נדירה, הגדלת מספר התאים לכל החזר ROI משפרת את האפשרות להתבונן בתאים מתמידים. עם זאת, מספר התא לא צריך לעלות על 300 תאים לכל החזר ROI, מכיוון שהדבר הופך את ניתוח התא הבודד למייגע.
    11. בצע הדמיית מיקרוסקופיה במצב זמן-lapse עם פריים אחד כל 15 דקות באמצעות האור המועבר ומקור אור העירור עבור מדווח הפלואורסצנט. כאן, נעשה שימוש במקור אור עירור של 560 ננומטר עבור אות mCherry (580 ננומטר LED בהספק של 10% עם מסנן 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] וחשיפה של 100 אלפיות השנייה עבור mCherry). תוכנת Zen3.2 התואמת ל-Zeiss שימשה להדמיית תאים.
  3. ניתוח תמונה
    הערה: הפתיחה וההדמיה של תמונות המיקרוסקופיה מבוצעות באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). ניתוח התמונה הכמותי מתבצע באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ImageJ/Fiji והתוסף החינמי MicrobeJ (https://microbej.com). בפרוטוקול זה נעשה שימוש בגרסת MicrobeJ 5.13I(14).
    1. פתח את תוכנת ImageJ/Fiji במחשב וגרור את תמונות המיקרוסקופ של היפר-סטאק לתוך סרגל הטעינה של פיג'י. השתמשו ב-Image > Color >-Make Composite כדי למזג את הערוצים השונים של ההיפר-אוסף. אם הערוצים של ניסוי זמן-lapse אינם תואמים את הצבע הרצוי (למשל, ניגודיות הפאזה מוצגת באדום במקום באפור), השתמש ב-Image > Color >-Arrange Channels כדי להחיל את הצבע המתאים על הערוצים.
    2. פתח את התוסף MicrobeJ וזהה את תאי החיידקים באמצעות ממשק העריכה הידנית. מחק את התאים שזוהו באופן אוטומטי ותאר באופן ידני את התאים המתמידים המעניינים מסגרת אחר מסגרת.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדרות שונות כדי לזהות תאים בודדים באופן אוטומטי. זיהוי ידני שימש כאן מכיוון שתאי המתמידים שנותחו יוצרים חוטים ארוכים, שלעתים רחוקות מזוהים כהלכה באמצעות זיהוי אוטומטי.
    3. לאחר הזיהוי, השתמש בסמל התוצאה בממשק העריכה הידנית של MicrobeJ כדי ליצור טבלת ResultJ. שמור את קובץ ResultJ והשתמש בו כדי לקבל תובנות לגבי פרמטרים שונים מעניינים בניתוח התא הבודד. בפרוטוקול זה יוצאו הקרינה הממוצעת של עוצמת ה-HU-mCherry , אורך התא ושטח התא של תאים בודדים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Axio Observerצייס מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך
פיג׳יתמונהJhttps://fiji.sc/תוכנת תמונה; Schindelin et al. אם נעשה בו שימוש בפרסום
אי קולי K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) BE10זן ייחוס Wt, זן מעבדה
אי קולי K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT BE16היתוך HU-mCherry משולב באמצעות התמרת P1 בלוקוס המקורי, זן המעבדה
מערכת מיקרופלואידית של CellASIC ONIXמרקCAX2-S0000מערכת מיקרופלואידית
צלחות מיקרופלואידיות CellASIC ONIXמרקB04A-03-5PKצלחת למערכת מיקרופלואידית
סלאסיק ONIX2 FGמרקONIX2 1.0.1תוכנה מיקרופלואידית
סעפת CellASIC ONIX2 בסיסיתמרקCAX2-MBC20מערכת סעפת
מיקרובי Jתוסף Imagej/Fijihttps://www.microbej.com/תוסף ניתוח תמונות מיקרוסקופיה. Ducret et al.for בפרסום; הגדרות זיהוי: עבור חיידקים: שטח (μm2): 0,1-max; אורך (מיקרומטר): 0,5 מקסימום; רוחב (מיקרומטר): 0,6-מקסימום; טווח (מיקרומטר): 0,5 מקסימום; זווית (rad): 0-0,3; 0-מקסימום עבור כל שאר הפרמטרים.
שמן טבילה צייס® 518Fצייס שמן טבילה להגברת הרזולוציה של המיקרוסקופ
Zen3.2 Proצייס תוכנה לקליטה ועיבוד של תמונות מיקרוסקופיות
אופלוקסציןמרק82419-36-1אנטיביוטיקה פלואורוקווינולון המשמשת לטיפול בתאי החיידקים
CaCl₂·2H₂Oמרק1.02382.0250עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
CoCl₂·6H₂Oמרק1.02539.0100עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
CuSO₄·5H₂Oמרק1.02790.0250עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
D-(+)-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7021-1 ק"גמקור פחמן לגלוקוז MOPS 0.4% מדיום גידול
FeSO₄·7H₂Oכימיקלים של VWR24244.232עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
גליצרולמרק56815מקור פחמן ל-MOPS גליצרול 0.4% מצע גידול
H₃BO₃סיגמא-אולדריץ'B6768-1 ק"געבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
K₂HPO₄מרק1.05099.1000עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
KOHמרק1.05029.1000עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
K₂SO₄מרק1.05153.0500עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
MgCl₂·6H₂Oמרק1.05832.1000עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
MnCl₂·4H₂Oמרק1.05927.0100עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
MOPS, חומצה חופשית בדרגת ULTROL®מרקברקוד 475898-500GMעבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
NaClסיגמא-אולדריץ'S5886-1 ק"געבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂Oמרק1.01180.0250עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
NH₄Clמרק1.01145.0500עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
N-[טריס(הידרוקסימטיל)-מתיל]-גליציןמרק1.08602.0250עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול
ZnSO₄·7H₂Oמרק1.08883.0500עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Time Lapse MicroscopyAntibiotic PersistenceBacterial CellsFluorescent ReporterNucleoid VisualizationSingle Cell AnalysisMicrofluidic PlateTime Lapse ImagingPersister CellsDNA Binding Protein

Related Articles