$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. דור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מתויג di-GMP מחזורי (c-di-GMP) מדווח Pseudomonas aeruginosa זן
- יש לחסן 5 מ"ל של מדיום מרק ליזוגני (LB) עם מושבה אחת של P. aeruginosa ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
- מעבירים 2 מ"ל מתרבית הלילה ל-200 מ"ל מדיום LB טרי בבקבוק של 1 ליטר ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
- עקוב אחר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) כל 30 דקות על ידי לקיחת דגימה של 1 מ"ל מהבקבוק ובדיקתה באמצעות ספקטרופוטומטר.
- כאשר ה-OD600 מגיע בין 0.3 - 0.5, הניחו 40 מ"ל מהתרבית לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-40 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה כקרח, סטרילית, 300 מ"מ.
- גלולה את התאים בפעם השנייה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 והשעיה מחדש ב-20 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה כקרח, סטרילית, 300 מ"מ.
- גלולה את התאים בפעם האחרונה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 והשעיה מחדש ב-400 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז קרה כקרח, סטרילית, 300 מ"מ.
הערה: צפיפות התאים בשלב זה צריכה להיות בערך 1 x 1011 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/ml). - מצננים את התאים על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן הם מוכנים לאלקטרופורציה.
- הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד של 0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר pCdrA::gfpC ל-40 מיקרוליטר של תאים מוכשרים אלקטרו-מוכשרים של P. aeruginosa שהוכנו לעיל בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל שצונן מראש על קרח. מערבבים את התרחיף ומעבירים אותו לקובטה אלקטרודה מקוררת מראש, 2 מ"מ, אלקטרופורציה.
- הסר לחות בחלק החיצוני של הקובט בעזרת נייר טישו והנח את הקובט בתא הדגימה של האלקטרופורטור. דופק במתח של 2.5 קילו וולט, קיבול של 25 μF והתנגדות של 200 Ω.
- הסר את הקובט והוסף 1 מ"ל מדיום LB. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל ודגרו למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
- מורחים 10 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר מהתרבית על צלחות LB-אגר סטריליות בתוספת אמפיצילין (בריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל), ודוגרים על הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- אשר את ביטוי ה-GFP (עירור ב-485 ננומטר, פליטה ב-520 ננומטר) על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי, ובחר מושבה בודדת לחיסון 5 מ"ל LB. דגירה למשך הלילה כמתואר בשלב 1.1. מערבבים 0.5 מ"ל מתרבית הלילה עם 0.5 מ"ל 50% גליצרול בצינור עליון של 2 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. הכנת תרבית ההתחלה לחיסון
- יומיים לפני המסך, צלחו את זן P. aeruginosa (המכיל את הפלסמיד pCdrA::gfpC ) ממלאי -80 מעלות צלזיוס על צלחת LB-אגר (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי פיזור עדין של החיידקים על הצלחת באמצעות לולאת חיסון סטרילית. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
- בערב שלפני ההקרנה, יש לחסן מושבה אחת של P. aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מ"ל של מדיום LB (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל) בשפופרת ולדגור את התרבית המוקדמת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
- ביום המסך, הכינו תת-תרבות מתרבית הלילה על ידי דילול תחילה במדיום LB טרי ל-OD600 של 1.0 ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB ל-OD600 של 0.04 (יחס של 1:25).
הערה: הנפח הכולל של המדיום המחוסן תלוי במספר הצלחות שיש לבדוק. 5% LB מיוצר על ידי דילול 100% LB עם מי מלח חוצץ פוספט (PBS) לריכוז הנדרש. חשוב לציין, המדיה (5% LB) מאפשרת הפעלה מכוננת של pCdrA::gfpC ב-P. aeruginosa. - הוסף מוט מערבל מגנטי סטרילי למיכל וערבב את התרבית במהירות מינימלית על מערבל מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר לחיידקים להתאקלם למדיה לפני שהם מופצים לצלחות של 384 בארות.
3. חיסון ודגירה של לוחות 384 בארות המכילים מולקולות קטנות
הערה: סטריליות וטכניקות אספטיות טובות הן בעלות חשיבות עליונה לשלבים הבאים.
- להכנת הבקרה החיובית (100% עיכוב), יש להוסיף 20 מיקרוליטר טוברמיצין סולפט (25 מ"ג/מ"ל) ל-10 מ"ל (מתאים לעד 12 צלחות) של תת-התרבות שהוכנה בשלב 2.3 ולערבב בעדינות. פיפטה 40 מיקרוליטר של תרבית הבקרה החיובית לבארות A23-P23 (איור 1).
- להכנת הבקרה השלילית (0% עיכוב), הוסיפו 30 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל -10 מ"ל (מספיק עד 12 צלחות) של תת התרבות שהוכנה בשלב 2.3 וערבבו בעדינות. פיפטה 40 מיקרוליטר של תרבית הבקרה השלילית לבארות A24-P24 (איור 1).
- עבור כל אחת מהלוחות המוטבעים במולקולות הקטנות, חסנו נפח של 40 מיקרוליטר מתרביות הלילה המדוללות (המתוארות בשלב 2.3) לתוך הבארות A1-P22 (איור 1).
הערה: ניתן להשיג זאת באמצעות רובוט מטפל בנוזלים. בשל התכונות ההטרוגניות של תרביות חיידקים, חשוב לשמור על תסיסה רציפה ומתונה כדי לשמור על הפצה עקבית של חיידקים במדיה בזמן החלוקה. לשם כך, המשיכו לערבב את התרבות המתאקלמת משלב 2.4 באופן מגנטי במהלך החלוקה. - אטמו את הלוחות עם אטם כיסוי חדיר אוויר ודגרו למשך 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: האיטום החדיר לאוויר הוא קריטי לשמירה על תנאים בלתי משתנים בכל 384 הבארות וכדי לעקוף את ההתפתחות הפוטנציאלית של שיפועי חמצן על פני הצלחת.
4. מדידת גדילה (OD600) ורמת c-di-GMP תוך-תאית (GFP)
- כ-30 דקות לפני המדידה הספקטרופוטומטרית, יש לחמם מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיבוי.
- הסר בעדינות את אטם הכיסוי החדיר לאוויר לפני הקריאה. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן התייצבות של 0.2 שניות.
- לפני מדידת הקרינה, בצע הגבר אוטומטי וכוונון מוקד על בסיס באר A24 (בקרה שלילית) והגדר את ערך יעד ההגבר על 75% (איור 1).
- מתוכנת בקרת קורא הלוחות, לחץ על התחל מדידה ולחץ על הכרטיסייה ''התאמת פוקוס ורווח/מזהי לוחות''.
- בחר ''התאמת מיקוד'' ו''ערוץ A'' בצד ימין בחלון.
- בחר ''התאמת רווח'' ו''נבחר היטב'', והקלד ''75'' כ''ערך היעד''. לבסוף, בחר היטב A24 בפריסת הצלחת לפני לחיצה על ''התחל התאמה''. לאחר ביצוע ההתאמה, לחץ על ''התחל מדידה''.
- מדוד את הקרינה ממדווח ה-GFP במקסימום עירור/פליטה של 485/520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן שקיעה של 0.2 שניות.
- אסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו.
הערה: קריאות הנתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנת בקרת קורא הלוחות.- צפה בקריאות על ידי לחיצה על סמל "מאדים" בתוך תוכנת הבקרה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטי.
- אחזר נתונים על ידי "לחיצה כפולה" על מספר הלוחית המעניינת כדי לגשת לנתונים לניתוח.
