טכניקה להכנת תרבית חיידקים חד שבטית

תקציר

מקור: Lin, P., et al. סינתזה של מיקרו-קפסולות נתרן טונגסטאט ונתרן מוליבדט באמצעות הפרשת מינרלים חיידקיים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים הכנת תרבית חיידקים חד שבטית לייצור מינרלים באמצעות דילול סדרתי ובידוד מושבה על צלחת אגר. על ידי ניעור הצלחת עם חרוזי זכוכית, תאים בודדים מופרדים מרחבית ליצירת מושבות אחידות מבחינה גנטית, אשר לאחר מכן מועברות למדיה נוזלית לצמיחה. נבחרת התרבות עם העכירות הגבוהה ביותר, המציינת את האוכלוסייה החד-שבטית הצפופה ביותר ואת הפוטנציאל הגדול ביותר לתפוקת מינרלים.

פרוטוקול

1. הכנת חרוזי זכוכית

1. מניחים 100 חרוזי זכוכית בקוטר 3 מ"מ בבקבוק מעבדה של 100 מ"ל, ולאחר מכן מכסים אותו היטב.
2. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. השאירו את הבקבוק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הניחו אותו בארון הבטיחות הביולוגית.

2. הכנת מרק ליזוגני (LB)

1. ממיסים 8 גרם אבקה של מרק LB-Lennox בבקבוק מעבדה של 500 מ"ל עם 400 מ"ל מים.
2. מערבבים את התוכן עם מוט ערבוב מגנטי פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) למשך 20 דקות, ולאחר מכן מכסים אותו היטב.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. השאירו את התמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית.
5. בעזרת פיפטה, מכניסים את המרק לשמונה צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל (12.5 מ"ל כל אחד) בארון הבטיחות הביולוגית.
6. מכניסים את המרק הנותר לשלושה בקבוקי מעבדה של 100 מ"ל בארון הבטיחות הביולוגית (100 מ"ל כל אחד). מכסים היטב את שלושת הבקבוקים. שמור אותם בארון הבטיחות הביולוגית.

3. תרבות אצות שוונלה

1. השתמשו בזן הקפוא בהקפאה עמוקה.
2. בארון הבטיחות הביולוגית, בחר 1 מ"ל מהחומר הקפוא מהצינור הקפוא בעזרת מרית נירוסטה, והנח אותו בצינור צנטריפוגה שהוכן בשלב 3.5.
3. דגרו על התרבויות למשך 24 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס.

4. הכנת מנות פטרי LB-Lennox (מרק עם אגר)

1. ממיסים שתי טבליות של LB-Lennox (מרק עם אגר) לבקבוק מעבדה של 100 מ"ל עם 100 מ"ל מים.
2. מערבבים את התוכן בעזרת מוט ערבוב מגנטי PTFE למשך 20 דקות ולאחר מכן מכסים אותו היטב.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. בארון הבטיחות הביולוגית, הכניסו ביד 100 מ"ל תמיסה ל-4 צלחות פטרי, והבטיחו שכל אחת מהן תקבל ~25 מ"ל. השאירו את התמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.

5. הכנת חיידקים חד שבטיים

1. בארון הבטיחות הביולוגית, סמנו את שלושת הבקבוקים שהוכנו בשלב 2.6, #1, #2 ו-#3, בהתאמה.
2. פיפטה 0.1 מ"ל של התרחיף החיידקי שנוצר בשלב 3.3 לתוך בקבוק #1. מכסים את הבקבוק ומניפים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל פיתרון הומוגני.
3. פיפטה 0.1 מ"ל של נוזל החיידקים שנוצר בשלב 5.2 לתוך בקבוק #2. מכסים את הבקבוק ומניפים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל פיתרון הומוגני.
4. פיפטה 0.1 מ"ל של נוזל החיידקים שנוצר בשלב 5.3 לתוך בקבוק #3. מכסים את הבקבוק ומנערים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל תמיסה הומוגנית.
5. הכניסו את הנוזל בבקבוק #3 לתוך 4 צלחות הפטרי שהוכנו בשלב 4.4, תוך שימוש בנפח של 0.02 מ"ל כל אחת.
6. הכניסו את חרוזי הזכוכית שהוכנו בשלב 1.3 לתוך 4 צלחות הפטרי המשמשות, 4 חרוזים בכל מנה.
7. סוגרים את מכסי כלי הפטרי ומנערים אותם ביד למשך דקה.
8. הופכים את כלי הפטרי ודוגרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

6. ריבוי חיידקים חד שבטיים

1. הביאו 7 צינורות שהוכנו בשלב 2.5.
2. בחר את החיידקים החד-שבטיים שנוצרו מ -4 צלחות הפטרי שהוכנו בשלב 5.8 בעזרת מרית נירוסטה, והכניס אותם ל -7 צינורות בנפרד.
3. השאירו את 7 הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
4. בחר את זה עם פיזור האור הגדול ביותר בשיטה הקולורימטרית החזותית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
LB (מרק לנוקס) עם טבליות אגר	סיגמא-אולדריץ'	L7075	טבליה אחת למרק 50 מ"ל עם אגר
LB (מרק לנוקס)	סיגמא-אולדריץ'	L3022-1 ק"ג	אבקת LB (Lennox) 1 ק"ג
דקסטרוז נטול מים	מגיב ניהון שיאקו	PL 78695	גלוקוז
צינור צנטריפודג' 50 מ"ל	בז	14-432-22
צינור צנטריפודג' 15 מ"ל	בז	14-959-53א
בקבוק מעבדה 100 מ"ל	דוראן	21 801 24 5
בקבוק מעבדה 500 מ"ל	דוראן	21 801 44 5
מרית נירוסטה	צ'מגלס	CG-1981-10
מוטות ערבוב חד פעמיים PTFE	פישר	S68066
צלחות פטרי מפלסטיק	פישר	S33580A
אינקובטור	מעשה ידי הלקוח	בהתאמה אישית	מחממים ל-40 מעלות צלזיוס או מצננים ל-18 מעלות צלזיוס עם קוטרול זמן
ארון בטיחות ביולוגית	Zong Yen ושות', בע"מ	זיב-420	כל התהליכים הקשורים לחיידקים נעשים כאן
אוטוקלאב	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., טאיפיי סיטי, טייוואן, ROC	TM-329	מחממים ל-120 מעלות למשך 10 דקות