סינתזה של מיקרו-קפסולות תחמוצת מתכת באמצעות חיידקים מפחיתי מתכות

תקציר

מקור: Lin, P., et al. סינתזה של מיקרו-קפסולות נתרן טונגסטאט ונתרן מוליבדט באמצעות הפרשת מינרלים חיידקיים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את ההליך לסינתזה של מיקרו-קפסולות תחמוצת מתכת קשיחות על ידי גידול חיידקים מפחיתי מתכת עם יוני מתכת, ולאחר מכן טיהור רציף באמצעות סוניקציה, צנטריפוגה ושטיפת אתנול.

פרוטוקול

זהירות: השתמש בכפפות לטקס, משקפי מגן ומעיל מעבדה לביצוע הניסוי. בכל פעם שאתה משתמש בארון הבטיחות הביולוגית, הפעל את מאוורר הארון והשאר את דלת הארון סגורה למחצה.

1. הכנת חרוזי זכוכית

1. מניחים 100 חרוזי זכוכית בקוטר 3 מ"מ בבקבוק מעבדה של 100 מ"ל, ולאחר מכן מכסים אותו היטב.
2. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. השאירו את הבקבוק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הניחו אותו בארון הבטיחות הביולוגית.

2. הכנת מרק ליזוגני (LB)

1. ממיסים 8 גרם אבקת מרק LB-Lennox בבקבוק מעבדה של 500 מ"ל עם 400 מ"ל מים.
2. מערבבים את התוכן עם מוט ערבוב מגנטי PTFE (פוליטטרפלואורואתילן) למשך 20 דקות, ולאחר מכן מכסים אותו בחוזקה.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. השאירו את התמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית.
5. בעזרת פיפטה, מכניסים את המרק לשמונה צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל (12.5 מ"ל כל אחד) בארון הבטיחות הביולוגית.
6. הכניסו את המרק הנותר לשלושה בקבוקי מעבדה של 100 מ"ל (100 מ"ל כל אחד) בארון הבטיחות הביולוגית. מכסים היטב את שלושת הבקבוקים ושומרים אותם בארון הבטיחות הביולוגית.

3. תרבות אצות שוונלה

1. השתמשו בזן הקפוא בהקפאה עמוקה.
2. בארון הבטיחות הביולוגית, בחר 1 מ"ל מהחומר הקפוא מהצינור הקפוא בעזרת מרית נירוסטה, והנח אותו בצינור צנטריפוגה שהוכן בשלב 3.5.
3. דגרו על התרבויות למשך 24 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס.

4. הכנת מנות פטרי LB-Lennox (מרק עם אגר)

1. ממיסים שתי טבליות של LB-Lennox (מרק עם אגר) לבקבוק מעבדה של 100 מ"ל עם 100 מ"ל מים.
2. מערבבים את התוכן בעזרת מוט ערבוב מגנטי PTFE למשך 20 דקות ולאחר מכן מכסים אותו היטב.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. בארון הבטיחות הביולוגית, הכניסו ביד 100 מ"ל תמיסה ל-4 צלחות פטרי, והבטיחו שכל אחת מהן תקבל ~25 מ"ל. השאירו את התמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.

5. הכנת חיידקים חד שבטיים

1. בארון הבטיחות הביולוגית, סמנו את שלושת הבקבוקים שהוכנו בשלב 2.6, #1, #2 ו-#3, בהתאמה.
2. פיפטה 0.1 מ"ל של התרחיף החיידקי שנוצר בשלב 3.3 לתוך בקבוק #1. מכסים את הבקבוק ומניפים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל פיתרון הומוגני.
3. פיפטה 0.1 מ"ל של נוזל החיידקים שנוצר בשלב 5.2 לתוך בקבוק #2. מכסים את הבקבוק ומניפים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל פיתרון הומוגני.
4. פיפטה 0.1 מ"ל של נוזל החיידקים שנוצר בשלב 5.3 לתוך בקבוק #3. מכסים את הבקבוק ומנערים אותו ביד למשך דקה אחת כדי לקבל תמיסה הומוגנית.
5. הכניסו את הנוזל בבקבוק #3 לתוך 4 צלחות הפטרי שהוכנו בשלב 4.4, תוך שימוש בנפח של 0.02 מ"ל כל אחת.
6. הכניסו את חרוזי הזכוכית שהוכנו בשלב 1.3 לתוך 4 צלחות הפטרי המשמשות, 4 חרוזים בכל מנה.
7. סוגרים את מכסי כלי הפטרי ומנערים אותם ביד למשך דקה.
8. הופכים את כלי הפטרי ודוגרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

6. ריבוי חיידקים חד שבטיים

1. הביאו 7 צינורות שהוכנו בשלב 2.5.
2. בחר את החיידקים החד-שבטיים שנוצרו מ -4 צלחות הפטרי שהוכנו בשלב 5.8 בעזרת מרית נירוסטה, והכניס אותם ל -7 צינורות בנפרד.
3. השאירו את 7 הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
4. בחר את זה עם פיזור האור הגדול ביותר בשיטה הקולורימטרית החזותית.

7. הכנת מרק LB-Lennox עם גלוקוז ומלח

1. הכניסו 10 גרם מרק LB-לנוקס, 10 גרם NaCl ו-10 גרם גלוקוז לבקבוק מעבדה של 500 מ"ל. מוסיפים מים עד שהנפח מגיע ל -450 מ"ל.
2. מערבבים את התוכן בעזרת מוט ערבוב מגנטי PTFE למשך 20 דקות.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

8. הכנת נתרן טונגסטט

1. הכניסו 16.5 גרם של Sodium Tungstate Na₂WO_{4.2H 2}O לבקבוק מעבדה של 100 מ"ל עם מרית נירוסטה. מוסיפים מים עד שהנפח מגיע ל -50 מ"ל.
2. מערבבים את התוכן בעזרת מוט ערבוב מגנטי PTFE למשך 20 דקות.
3. חיטוי התכולה ב-120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. בארון הבטיחות הביולוגית, קבל סינון דרך מסנן פיברגלס ואקום עם נקבוביות של 1 מיקרומטר.

9. הכנת LB עם גלוקוז, מלח ונתרן טונגסטט

1. בארון הבטיחות הביולוגית, שפכו ביד את המסנן שנצבר בשלב 8.4 לתמיסה עם גלוקוז ומלח שהוכנו בשלב 7.3.
2. בארון הבטיחות הביולוגית, יש לחבר עם פיפטה את התמיסה המתקבלת של 500 מ"ל בשלב 9.1 לצינורות צנטריפוגה של 10 x 50 מ"ל.

10. תרבית חיידקים

1. בארון הבטיחות הביולוגית, הביאו את הנוזל שהוכן בשלב 6.4 והכניסו אותו עם פיפטה לתוך 10 המבחנות שהוכנו בשלב 9.2, כאשר כל צינור מקבל 0.05 מ"ל.
2. דגרו את 10 הצינורות בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 120 שעות.

11. קציר מינרלים BME

1. אולטרסאונד כל אחד מ-10 הצינורות בשלב 9.2 ב-20 קילו-הרץ עם 150 וואט למשך שעה.
2. צנטריפוגה את הצינורות ב-2,025 x גרם למשך שעה.
3. הסר את הנוזל הצלול בצינורות בעזרת פיפטה, הוסף מים ולאחר מכן חזור על שלבים 11.1 ו- 11.2 פעם נוספת.
4. הסר את הנוזל הצלול בצינורות בעזרת פיפטה, הוסף אלכוהול ולאחר מכן עשה אותם באולטרסאונד ב -20 קילוהרץ עם 150 וואט למשך שעה.
5. צנטריפוגה את הצינורות ב-2,025 x גרם למשך שעה.
6. חזור על שלבים 11.4 ו- 11.5 פעם נוספת
7. קציר מינרלים BME על ידי הסרת הנוזל הצלול בצינורות בעזרת פיפטה; לאחר מכן, מכסים מיד את הצינורות מבלי להפעיל תהליך ייבוש כלשהו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מרק LB (לנוקס) עם טבליות אגר	סיגמא-אולדריץ'	L7075	טבליה אחת למרק 50 מ"ל עם אגר
מרק LB (לנוקס).	סיגמא-אולדריץ'	L3022-1 ק"ג	אבקת LB (Lennox) 1 ק"ג
דקסטרוז נטול מים	מגיב ניהון שיאקו	PL 78695	גלוקוז
נתרן טונגסטט	מגיב ניהון שיאקו	PL 76050	מה2ו4 · 2H2O
נתרן כלורי	מגיב ניהון שיאקו	PL 68131	NaCl
אתנול 99.5%	אקרוס אורגני	AC615090040	CH3CH2OH
מים	תוצרת האוניברסיטה שלנו		מים דה-יוניזציה
אוטוקלאב	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., טאיפיי סיטי, טייוואן, ROC	TM-329	מחממים ל-120 מעלות למשך 10 דקות
צנטריפוגה	מערכת מעבדת מערכת ספרות, טאיפיי סיטי החדשה, טייוואן, ROC	DSC302SD	צנטריפוגה במשקל 2025 x גרם
-80 מעלות צלזיוס מקרר	פנסוניק	MDF-U3386S	השתמש להקפאה עמוקה של זן שימור בהקפאה
הומוגנייזר אולטרסאונד סוניקטור מעבד משבש תאים	לנוקס	UPS-150	תדר 20 קילו-הרץ הספק 150 וואט
אינקובטור	מעשה ידי הלקוח	בהתאמה אישית	מחממים ל-40 מעלות צלזיוס או מצננים ל-18 מעלות צלזיוס עם קוטרול זמן
אמבטיות טלטול הדדיות	קינגטק סיינטיפיק ושות', בע"מ	WBS-L
פלטה חמה ערבוב דיגיטלית	קורנינג	#6797-620 ד	השתמש עם מוט ערבוב מגנטי PTFE
ארון בטיחות ביולוגית	Zong Yen ושות', בע"מ	זיב-420	כל התהליכים הקשורים לחיידקים נעשים כאן
צינור צנטריפודג' 50 מ"ל	בז	14-432-22
צינור צנטריפודג' 15 מ"ל	בז	14-959-53א
בקבוק מעבדה 100 מ"ל	דוראן	21 801 24 5
בקבוק מעבדה 500 מ"ל	דוראן	21 801 44 5
מרית נירוסטה	צ'מגלס	CG-1981-10
מוטות ערבוב חד פעמיים PTFE	פישר	S68066
צלחות פטרי מפלסטיק	פישר	S33580A
אצות שוונלה	באדיבות מחבר #3	באדיבות מחבר #3