הערכת ההשפעה של חיידקים מועילים על טרנסלוקציה של חיידקי מעיים בחולדות עם סטרס חום

תקציר

מקור: Sorokulova, I., et al. מניעת תופעות לוואי של מתח חום בחולדות על ידי זן Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים חולדות שטופלו מראש בחיידקים מועילים או בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) ונחשפו ללחץ חום כדי להעריך את תקינות מחסום המעי. פחות מושבות חיידקים שמקורן במעיים מהכבד של חולדות שטופלו, בניגוד למושבות רבות בחולדות ביקורת, מצביעות על מחסום אפיתל שלם וטרנסלוקציה מינימלית של חיידקים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. תכנון ניסוי

1. התחל את הטיפול בבעלי חיים על ידי גבאז' דרך הפה, לאחר יומיים של התאקלמות. השתמש במזרק עם מחט הגוואג' דרך הפה. טפל ב-16 חולדות עם תרחיף Bacillus subtilis BSB3 (1 מ"ל לחולדה) פעמיים ביום למשך יומיים (קבוצת B. subtilis). טפלו ב-16 חולדות עם מי מלח עם פוספט, PBS (1 מ"ל לחולדה), פעמיים ביום במשך יומיים (קבוצת PBS) (איור 1).
2. לאחר הטיפול, חלקו כל קבוצה (8 חולדות לקבוצה): קבוצה 1-ביקורת (PBS/ללא עקה), קבוצה 2-B. subtilis (B. subtilis /ללא לחץ), קבוצה 3-עקה (PBS/עקת חום) וקבוצה 4-B . subtilis + מתח (B. subtilis/עקת חום).
3. מדוד את טמפרטורת פי הטבעת של כל חולדה באמצעות מדחום דיגיטלי אלקטרוני. שמור חולדות מקבוצות 1 ו -2 בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. הניחו בעלי חיים מקבוצות 3 ו-4 בתא אקלים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס ו-55% לחות יחסית למשך 25 דקות.
4. לאחר מכן, מדדו את טמפרטורת פי הטבעת של כל חולדה בכל הקבוצות באמצעות מדחום דיגיטלי אלקטרוני. מניחים את כל בעלי החיים בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות.
5. להרדים חולדות עם איזופלורן (2 - 4%) בצנצנת הרדמה אטומה ולהתבונן עד שהחולדות מורדמות עמוק (היעדר תגובה לצביטה בבוהן). המתת חסד של חולדות על ידי עריפת ראש מהירה עם גיליוטינה.
6. אסוף דם תא המטען מכל חולדה (15 - 16 מ"ל) עם הפיפטות האפירוגניות לצינורות אפירוגניים כדי להשיג סרום, וקח מיד דגימות דם (7 מיקרוליטר מכל חולדה) עם פיפטה לבדיקה מיקרוסקופית.
7. הכניסו את הצינורות עם הדם למקרר למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר קרישה. צנטריפוגה את הצינורות ב-20 מעלות צלזיוס, 7,000 x גרם למשך 10 דקות, והסר במהירות את הסרום בעזרת פיפטה. יש לצרף את הסרום המתקבל מכל חולדה לנפחים של 50 מיקרוליטר ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לבדיקה.

2. הליך כירורגי

1. חותכים/חותכים את כל הפרווה מהבטן ובית החזה של החלק התחתון של הפגר בעזרת מספריים חשמליים. הניחו את הפגר בארון סטרילי וטפלו במשטח המגולח של הפגר ב-70% אלכוהול.
2. השתמש באזמל סטרילי כדי ליצור חתך בקו האמצע של הבטן. הסר את הכבד, בלוטות הלימפה המזנטריות, הטחול והמעי הדק מכל חולדה באמצעות פינצטה סטרילית.

3. ניתוח טרנסלוקציה של חיידקים

1. הנח כל דגימה של כבד, בלוטות לימפה מזנטריות וטחול לצינורות סטריליים שנשקלו מראש ושקל. חשב את משקל המדגם כהפרש בין משקל צינור עם דגימה למשקל צינור ריק.
2. הוסף PBS סטרילי לצינור כדי לקבל דילול של 1:10 (משקל לנפח, w/v) של הדגימה והומוגניזציה של כל דגימה עם הומוגנייזר רקמת זכוכית סטרילי לקבלת תרחיף הומוגני.
3. בצע דילולים סדרתיים (^10-1 עד ^10-4) של כל דגימה ב-PBS סטרילי. צלחת 0.1 מ"ל מכל הדילולים של כל רקמה על פני השטח של אגר הדם של MacConkey ו-5% אגר דם ואגר דם ברוצלה עם המין (0.005 גרם/ליטר) וויטמין K1 (0.01 גרם/ליטר).
4. דגירה של צלחות אגר דם של מקונקי ו-5% באופן אירובי וצלחות אגר דם ברוצלה בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 ^{מעלות צלזיוס}.
5. ספרו מושבות של חיידקים אירוביים לאחר 24 שעות, ומושבות של חיידקים אנאירוביים לאחר 48 שעות של דגירה באמצעות מונה מושבות. בטא את התוצאות כמספר היחידות היוצרות מושבה (CFU) בגרם רקמה.

תוצאות

איור 1. עיצוב מחקר. שתי קבוצות של חולדות (16 חולדות בכל קבוצה) טופלו על ידי גבאז' דרך הפה עם Bacillus subtilis BSB3 (קבוצת B. subtilis ) או עם PBS (קבוצת PBS) פעמיים ביום. ביום השלישי, כל קבוצה חולקה ל-8 חולדות ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	עמ' 4417
אלכוהול אתילי	מוצרי פארמקו בע"מ ברוקפילד, קונטיקט, ארה"ב	64-17-5
אגר	VWR	97064-334
צלחות אגר MacConkey	VWR	470180-742
5% צלחות אגר דם	VWR	89405-024
צלחת אגר דם ברוצלה עם המין וויטמין K	VWR	89405-032
תא סביבתי 6020-1	קארון, מריאטה, אוהיו, ארה"ב	6020-1
צנטריפוגה	בקמן קולטר, אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב	אופטימה L-90K
מונה מושבה	פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב	RE-3325
מקפיא	האייר, ברוקלין, ניו יורק, ארה"ב	HCMO50LA
פיפטות	Gilson, Pipetman, צרפת	P100, P200, P1000
צלחות פטרי (100 מ"מ על 15 מ"מ)	פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב	875713
SterilGard III אדוונס	חברת בייקר, סנפורד, מיין, ארה"ב	SG403
הומוגנייזר רקמות, Dounce	VWR	71000-518