ייצור ושקיעה מבוססת אירוסול של נבגי Bacillus subtilis

תקציר

מקור: Fuchs, F. M., et al. חקירת ההשפעות המזיקות של עיקור פלזמה בלחץ נמוך על הישרדותם של נבגי Bacillus subtilis באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הייצור, הטיהור והשיקוע מבוסס אירוסול של נבגי Bacillus subtilis ליצירת שכבה חד-שכבתית אחידה, המאפשרת יישומים במורד הזרם כגון ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה של נביטת נבגים, כדאיות או תגובת מתח.

פרוטוקול

1. Bacillus subtilis ייצור וטיהור נבגים

1. לייצור נבגים, העבירו תרבית לילה של 5 מ"ל של זן B. subtilis המתאים, בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה, ל-200 מ"ל נוזל בעל חוזק כפול Schaeffer sporulation medium (לליטר 16 גרם מרק תזונתי, KCl (אשלגן כלורי) 2 גרם, 0.5 גרם MgSO₄*7 H₂O (מגנזיום גופרתי הפטהידרט), 2 מ"ל 1 M Ca(NO₃)₂ (סידן חנקתי), 2 מ"ל 0.1 מ' MnCl₂ *• 4 H₂O (מנגן כלוריד טטרהידרט), 2 מ"ל 1 מ"מ FeSO₄ (ברזל גופרתי), 2 מ"ל 50% (w/v) גלוקוז18) ולטפח אותו עם אוורור נמרץ ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות או עד > 95% מהתרבית נבגה. נעשה שימוש בנבגים של הזנים הבאים: B. subtilis PY79 (סוג פראי) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (חסר חלבון תיקון DNA RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA התמזג עם חלבון פלואורסצנטי צהוב [YFP]).
2. קצירת נבגים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-3,000 x גרם בצינורות של 50 מ"ל וטהר את הדגימות על ידי שלבי שטיפה חוזרים ונשנים (עד פי 15) באמצעות H₂O מזוקק סטרילי ולבדוק את מצב הטוהר והנביטה על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. ודא כי תרחיפי הנבגים מורכבים מנבגים בהירים פאזה (> 99%) והם נקיים מתאים צמחיים (מוטות), נבגים מונבטים (מראה שחור/אפור) ופסולת תאים; אחרת, ניסויי מיקרוסקופיה נוספים עלולים להיות מופרעים. שוטפים את הדגימה עד להגעה לטוהר הרצוי.
3. קבע את טיטר הנבגים על ידי ציפוי של 50 מיקרוליטר של דילולים טוריים פי 10 על LB (לוריה-ברטאני)-אגר (כלומר: השתמש בדגימה של 30 מיקרוליטר + 270 מיקרוליטר מים סטריליים לדילול של 1:10. קח 30 מיקרוליטר מהדילול המסוים ל-270 מיקרוליטר H₂O לדילול של 1:100 וכן הלאה) כדי לחשב את ה-CFU (יחידות יוצרות מושבה) ולדגור את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר קביעת CFU, התאם את הדגימה ל-10⁹ נבגים למ"ל על ידי ריכוז או דילול במים סטריליים.

2. הכנת מדגם של נבגי Bacillus subtilis שהושקעו בתרסיס

הערה: הצטברות וחפיפה של נבגים עלולה להוביל להשפעות הצללה במהלך הטיפול, ובסופו של דבר לגרום לקינטיקה של אינאקטיבציה מזויפת. כדי למזער בעיה זו, הכינו דגימות נבגים בטכניקת שקיעת אירוסול. בקצרה, שלוט בזרבובית הדו-חומרית בעלת הדיוק הגבוה באמצעות טיימר חשמלי המווסת את תפוקת הנוזל בתיאום עם זרימת הגז הנשא בלחץ (כאן N₂). פזרו את דגימת הנוזל המוזרקת דרך יציאת הזרבובית באמצעות זרימת גז החנקן.

1. הנח מנשא דגימה בצורת שקופיות מיקרוסקופיות מעוקרות (לקינטיקה הישרדותית) או כיסוי עגול של 25 מ"מ (למעקב פלואורסצנטי של תהליכי תיקון DNA/cLSM; מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי) בתוך יחידת ריסוס התרסיס המופעלת חשמלית ביישור עם הזרבובית. ריכוז הנבגים המשומש צריך להתאים פי מאה מהריכוז הסופי הרצוי.
2. העבירו 1 מ"ל מתרבית הנבגים לכניסת נוזל הזרבובית והתחילו את תהליך הריסוס של 0.1 שניות בלחץ של 1.3 בר. תרחיף הנבגים המרוסס (1 x 10⁷) יוצר סרט דק על המגלשה המיקרוסקופית שמתייבש במהירות תוך שניות ליצירת חד-שכבת נבגים מפוזרת באופן אחיד. אחסן את נושאי הדגימה המטופלים בכלי סטרילי בטמפרטורת החדר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיית שני חומרים (דגם 970-8)	שליק	14,404	230 וולט, 50 הרץ, עומק 4.484/8, קוטר קדח של 0.8 מ"מ
לוריא ברטאני בינוני	סיגמא אולדריץ'	70122-100 גרם
מחברי צינור	פסטו	לא ישים	G 1/8
מגלשות זכוכית	VWR	48300-026
תא תא אטופלואור	מנזל, פישר ר.	3406816	d=25 מ"מ, עגול
מגנזיום גופרתי הפטהידרט	סיגמא אולדריץ'	13152
סידן חנקתי	סיגמא אולדריץ'	202967
מנגן כלוריד טטרהידרט	סיגמא אולדריץ'	244589
ברזל גופרתי	AppliChem	13446-34-9
גלוקוז	מרק	215422
אשלגן כלורי	סיגמא אולדריץ'	P9541-500G
מרק מזין (NB)	מרק	105443
לוריא-ברטאני (ל"ב)	מרק	110283
96-באר	תרמו-פישר	243656