ניתוח כדאיות של Microcystis aeruginosa באמצעות ציטומטריית זרימה

תקציר

מקור: צ'פמן, I. J., et al., אופטימיזציה של בדיקה מולקולרית לקביעת תמותת תאים באורגניזם פוטוסינתטי (Microcystis aeruginosa) באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את השיטה להבחנה בין תאי Microcystis aeruginosa חיים ומתים על ידי שילוב של תיוג בדיקה פלואורסצנטית עם ניתוח ציטומטרי זרימה של אוטו-פלואורסצנציה של פיקוציאנין ואות בדיקה.

פרוטוקול

1. אופטימיזציה של קליטת תאי בדיקה מולקולרית

1. קצרו מחצית מתרבית M. aeruginosa משלב אקספוננציאלי והשתמשו בה כבקרה 'חיה'.
   הערה: דגימות מדוללות מתרבית בצפיפות גבוהה היישר לשלב אקספוננציאלי עשויות להשפיע על תוצאות האופטימיזציה באמצעות תחלופת תאים מתים בהשוואה לתרביות שחוסנו משלב השהיה/אינדוקציה ראשוני.
2. הכן את החצי השני כבקרה 'מתה' על ידי שימוש בשיטות כגון 70% אתנול, חימום דגימות ב-60 ^{מעלות צלזיוס}למשך שעה, פרפורמלדהיד או 4% פורמלדהיד למשך 30 דקות. בדוק שינויים במיקרו-סביבה של הדגימות (למשל, pH).
   הערה: הבקרה החיובית, המומתת בחום, 'מתה' ב-M. aeruginosa נבדלת מדגימה 'חיה' באמצעות הירידה שלה באותות פיקוציאנין. גרימת תמותה בשיטות אחרות עשויה שלא לגרום לאותה תפוקה ותשתנה בין המינים.
3. הגדר דגימות מעורבות באמצעות יחסים שונים של דגימות 'חיות' ו'מתות' (למשל, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. פירוק היווצרות מושבה על ידי מערבולת או סוניקציה ובדיקת pH.
5. בחר לייזר 488 ננומטר לצד גלאים שיכולים להקליט פלואורסצנטיות מבדיקות חומצות הגרעין הירוקות (ערוץ פלואורסצנטי 1 או FL1, 530 ± 15 ננומטר) והכתום (ערוץ פלואורסצנטי 2 או FL2, 585 ± 20 ננומטר) ולייזר 640 ננומטר כדי להקליט אותות פיקוציאנין דרך הגלאי המתאים לו.
   הערה: כאשר היא קשורה ל-DNA, לבדיקת חומצת הגרעין הירוקה יש אורך גל עירור פלואורסצנטי משוער של 504 ננומטר ומקסימום פליטה של 523 ננומטר, בעוד שלבדיקת חומצת הגרעין הכתומה יש אורך גל עירור של 547 ננומטר ומקסימום פליטה של 570 ננומטר. ניתן להשתמש בלייזר מצב מוצק של יון ארגון 488 ננומטר כדי לעורר את שתי הבדיקות המולקולריות, עם זאת, לייזר ירוק (עד 547 ננומטר) יפיק פלואורסצנציה כתומה גבוהה יותר.
6. כנקודת התחלה, הכניסו את הגשושית המולקולרית בריכוז המומלץ של היצרן לתרבית של 50% 'חיה' ו-50% 'מתה' ודגרו בחושך.
7. בחר תא נתונים חדש, מקם את הדגימה מתחת ליציאת ההקדמה לדוגמה (SIP) עם ספים וטריגרים שיפחיתו רעשי רקע (FSC-H או גובה פיזור קדימה, 80,000).
8. צור תרשים צפיפות עם פרמטרים FSC-H ו- SSC-H (גובה פיזור צדדי) ושלוש היסטוגרמות. היסטוגרמה אחת משתמשת בערוץ הגלאי האופטי של הגשושית המולקולרית המתאימה (FL1 או 2), האחת לאיתור פליטות פיקוציאנין (גובה ערוץ פלואורסצנטי 4 או FL4-H), והשנייה, FSC-H, הכל בסולם לוג.
9. דגרו על דגימות M. aeruginosa עם בדיקות חומצת הגרעין בחושך למשך עד 60 דקות, תוך רישום בתאי נתונים נפרדים בנקודות זמן שונות (1, 5, 10, 15, 30 ו-60 דקות).
   הערה: בעת התאמת פרמטרים כגון pH, בדוק עם היצרנים אם יש תגובות פוטנציאליות מכימיקלים מסוימים (עבור בדיקות חומצות הגרעין שנבדקו, מאגר אינו יכול להכיל פוספטים או רמות גבוהות של קטיונים חד-ערכיים או דו-ערכיים, מכיוון שהקישור עם ה-DNA יצטמצם).
10. החל שער תוכנה כדי לכלול רק את ההיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000) עבור גודל התא של אורגניזם המטרה בהיסטוגרמה של ערוץ בדיקת הקרינה המתאימה.
    הערה: הריכוזים ששימשו בפרוטוקול זה היו 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ו-100 מיקרומטר, אותם ניתן לשנות על ידי הגדלה או הקטנה של נפח דגימת M. aeruginosa או תמיסת המלאי הראשונית של בדיקות גרעין.
11. בערוץ בדיקת הקרינה, החל שער תוכנה כולל נוסף על הפסגה הגבוהה ביותר בהיסטוגרמה (FL1-H ירוק, 240,000 - 1,650,000, כתום FL2-H, 30,000 - 165,000) ולאחר מכן שער את הקרינה החיובית לתוך עלילת הצפיפות.
12. הפעל את שלבים 3.1 - 3.11 עם 100% "חי", 100% "מת" וכל דגימות התרבית המעורבות, תוך התאמת ריכוזי הבדיקה המולקולריים (למשל, x 0.1 עד x 10) ו/או רמות הטמפרטורה וה-pH במידת הצורך.
13. השווה את מספר אותות הקרינה של בדיקה מולקולרית חיובית לצפיפות התאים המקורית של תאים 'מתים' (שנלקחו ממחצית מכלל FSC-H או תרבית 'מתה' של 100%) כדי למצוא את האחוז הכולל של התאים הצבועים בבדיקות חומצות הגרעין.
14. עשה זאת עבור כל פרק זמן בתוך כל ריכוז כדי למצוא את הפרוטוקול האופטימלי לאחוז הגבוה ביותר של קליטת גרעין התא מבלי לייצר צביעה לא ספציפית (השתמש באמצעים בניתוח חד כיווני של שונות, ANOVA או ניתוח חד כיווני של שונות Kruskal-Wallis אם הנתונים אינם פרמטריים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציאנובקטריה מדיה	סיגמא-אולדריץ'	C3061-500 מ"ל	BG-11 תמיסה מרוכזת במים מתוקים (דילול x50)
נוזל טיהור	BD Biosciences	653155	הפעל במשך 2 דקות כאשר הפלטים הם יותר מ-12 אירועים לשנייה במהירות או בקצב זרימה של 66 מיקרוליטר לדקה. ואחריו 2 דקות של נדן H2O.
ציטומטר זרימה	BD Biosciences	לפי בקשה	BD אקורי C6
ירוק SYTOX	טכנולוגיות חיים	S7020	כתם חומצת גרעין - תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO
SYTOX כתום	טכנולוגיות חיים	S11368	כתם חומצת גרעין - תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO