הערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של וריאנטים של ניסין באמצעות בדיקת דיפוזיה של אגר באר

תקציר

מקור: Nickling, J. H., et.al. פפטידים אנטי-מיקרוביאליים המיוצרים על ידי שילוב לחץ סלקטיבי של חומצות אמינו לא קנוניות. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים בדיקת דיפוזיה של באר אגר המשמשת להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של וריאנטים של ניסין. הוא מראה כיצד לקטוקוקוס לקטיס המבטא את הפפטידאז הקשור לממברנה NisP מפעיל קודמני ניסין המיוצרים ב-E. coli, וכתוצאה מכך הילות עיכוב גדילה. גודלן של הילות אלה משקף את הפעילות הביולוגית של כל וריאנט ניסין.

פרוטוקול

1. בדיקת פעילות מיקרוביאלית

1. הכנת צלחות GM17-agar בתנאים סטריליים
   1. הכן תרבית לילה של זן האינדיקטור L. lactis NZ9000 הנושא פלסמיד pNG nisPT ב-30 מעלות צלזיוס במרק M17 עם 1% (w/v) גלוקוז (=GM17) ו-5 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול.
   2. למדוד OD₆₀₀, לחסן מדיום טרי ל-OD₆₀₀ = 0.1 ולדגור עד OD₆₀₀ = 0.4-0.6. לאחר מכן הניחו את הבקבוק על קרח.
      הערה: כל מדידת OD₆₀₀ תצרוך נפח תרבית. זכור כי עבור כל צלחת אגר בדיקה, יהיה צורך בתרבית חיידקים של 1 מ"ל. במידת הצורך, הגדל את נפח התרבות הנוזלית בהתאם.
   3. עבור 1.5% אגר, שקלו 4.5 גרם אגר בבקבוק מדיה מזכוכית. מוסיפים 300 מ"ל ddH₂O, מערבבים ומחטטים.
   4. מכינים 2x מרק M17 (מרוכז פעמיים) ב -300 מ"ל ddH₂O וחיטוי.
   5. יש לערבב 25 מ"ל מרק 2x M17 המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ו-2% גלוקוז עם תרבית מוקדמת של 1 מ"ל L. lactis (4% v/v).
   6. מוסיפים 25 מ"ל אגר מותך 1.5% (חיטוי טרי או מחומם במיקרוגל).
      הערה: לפני כן, הניחו לבקבוק להתקרר למגע (בסביבות 50 מעלות צלזיוס). זה הכרחי מכיוון שלקטובצילוס לקטיס הוא אורגניזם מזופילי הרגיש לטמפרטורות גבוהות.
   7. שופכים את התמיסה לצלחת פטרי גדולה. צלחות יבשות למשך 10-15 דקות.
   8. מעקרים את הקצוות של פיפטת פסטר מזכוכית על ידי להבה. המתן עד שיתקרר, ולאחר מכן השתמש בקצה הרחב כדי ליצור חורים ב-GM17-אגר המוצק.
2. הכנת מדגם
   1. קח 1 מ"ל של תרביות ביטוי E. coli בשפופרת מסומנת של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב-7,000 x גרם. שאפו את המדיום הנותר והשעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר Na-P (50 מ"מ מאגר נתרן פוספט, pH 7.4 עשוי מ-0.5 מ' נתרן דימימן פוספט ו-0.5 מ' דיסודיום מימן פוספט).
   2. סוניקציה של הדגימות על קרח. טבלו את קצה בדיקת הסוניקטור לתוך מתלה התא. הגדר את הסוניקטור במשרעת של 30% עם דופק של 1 שניות דולק ו-5 שניות כבוי למשך 3 דקות.
   3. צנטריפוגה של התא ליזאט למשך 10 דקות ב-13,000 x g כדי לגלול פסולת תאים. העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש על קרח.
   4. לדלל ולנרמל את תמצית התאים ל-1 מ"ל OD₆₀₀ = 0.6, ביחס לצפיפות התאים שנקטפו, עם Na-P.
3. בדיקת פעילות
   1. הוסף 40 μL מכל דגימה מנורמלת לתוך חור של לוחית אגר המחוון (איור 1). השתמש בכלורמפניקול ב-400 מיקרוגרם/מ"ל כתרכובת בקרה אנטיבקטריאלית. השתמש במאגר פליטה כבקרה שלילית. המתן עד שכל הדגימות יתפזרו לתוך האגר. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס.
   2. צלם תמונות של לוחות האגר באמצעות סורק שטוח או מצלמה דיגיטלית. ניתן למדוד גדלי הילה של עיכוב גדילה ביד או באמצעות ImageJ.

תוצאות

איור 1. בדיקת פעילות אנטי-מיקרוביאלית של ליזאטים תאים המכילים גרסאות ניסין המיוצרים באמצעות SPI עם אנלוגים של פרולין. השוואה בין גרסאות ניסין עם דגימות רקומביננטיות מסוג בר. כל הדגימות נורמלו OD_600<...

חומרים