הכנת מדיום ליחה מלאכותי לחיקוי כיח ריאות סיסטיק פיברוזיס ex vivo

תקציר

מקור: Vieira, J., et al. תכנון ופיתוח מודל לחקר השפעת תוספת חמצן על המיקרוביום של דרכי הנשימה של סיסטיק פיברוזיס. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את הכנת מדיום ליחה מלאכותי המחקה את הצמיגות, הרכב החומרים המזינים וה-pH של כיח ריאות סיסטיק פיברוזיס. המדיום המתקבל מספק פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית למחקרי ex vivo.

פרוטוקול

1. הכנה בינונית ליחה מלאכותית

הערה: הכמויות המפורטות כאן מיועדות לייצור של 1 ליטר של מדיום ליחה מלאכותי סופי, ומניחות את הריאגנטים הספציפיים המפורטים בטבלת החומרים. יש להתאים את המספרים לנפחים אחרים או לשימוש בריאגנטים שונים כדי להבטיח את אותו מוצר סופי. ראה טבלה 1 לריכוזי היעד.

1. תערובת כימית של כיח מלאכותי (ASCM)
   הערה: ASCM מהווה 25% מהנפח הבינוני הסופי. הוא יציב על המדף וניתן להכין אותו בכמויות גדולות או מראש. אם מכינים אותו לשימוש מאוחר יותר, יש לבצע חיטוי של התערובת הכימית ולאחסן אותה בבטחה בטמפרטורת החדר.
   1. מערבבים את תמיסות המלאי הכימיות המרכיבות.
      1. הכן 1 M מלאי NaCl: הוסף 58.44 גרם NaCl לליטר מים סטריליים.
      2. הכן מלאי 1 M KCl: הוסף 74.55 גרם KCl לליטר מים סטריליים.
      3. הכן 1 M MgSO₄ ציר: הוסף 246.47 גרם MgSO₄·7H₂O לליטר מים סטריליים, או 120.37 גרם MgSO₄ נטול מים לליטר מים סטריליים.
      4. הכן מלאי גלוקוז 1 M: הוסף 180.16 גרם גלוקוז לליטר מים סטריליים.
   2. חיטוי חיטוי תמיסות המלאי הכימי, כמו גם בקבוק ריק של 250 מ"ל. בצע את שלבי החיטוי לערכים סטנדרטיים לפחות של 121 מעלות צלזיוס ו-15 PSI למשך 30 דקות.
   3. הוסף 80.59 מ"ל מים סטריליים לבקבוק הריק של 250 מ"ל.
   4. הוסף 152.30 מ"ל של מלאי NaCl 1 M לתערובת.
   5. הוסף 15.8 מ"ל של מלאי 1 M KCl לתערובת.
   6. הוסף לתערובת 610 מיקרוליטר של 1 M MgSO₄ ציר.
   7. הוסף לתערובת 700 מיקרוליטר של ציר גלוקוז 1 M.
2. תערובת מוצין כיח מלאכותי (ASMM)
   הערה: ASMM מהווה 50% מהנפח הבינוני הסופי. ודא שהוא מוכן באותו יום כמו המנה הבינונית הסופית.
   1. הוסף 450 מ"ל מים סטריליים לבקבוק ריק של 1 ליטר.
   2. הוסף 50 מ"ל של 10x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לבקבוק.
   3. הוסף מוט ערבוב מגנטי חד פעמי לבקבוק.
   4. חיטוי הבקבוק המכיל PBS ומוט הערבוב.
   5. מודדים 10 גרם אבקת מוצין ומוסיפים אותה ל-PBS.
   6. לנער את הבקבוק במרץ לערבוב ראשוני.
   7. הניחו את הבקבוק על פלטה חמה בעזרת מערבל מגנטי. מכוונים את החום לבינוני-גבוה, מכוונים ל-50 מעלות צלזיוס ומהירות הערבוב ל-1100 סל"ד. הגבירו את המהירות בהדרגה כדי שהמוט לא יעוף מהמגנט.
      1. מניחים להתחמם ומערבבים במשך 15 דקות.
      2. הרם את הבקבוק עם כפפות עמידות בחום. שימו לב לבדוק אם אבקת המוצין מתיישבת מהתמיסה.
      3. אם אבקת המוצין לא נמסה במלואה, החזירו את הבקבוק לחום/בוחש למשך 5 דקות עד להמסה מלאה.
   8. הניחו לתערובת המוצין להתקרר לטמפרטורת החדר.
3. תערובת ביולוגית של כיח מלאכותי (ASBM)
   הערה: ASBM הוא 25% מהנפח הבינוני הסופי. הכינו אותו באותו יום כמו המנה הבינונית הסופית, ובניגוד לתערובות האחרות, אל תחשפו את מרכיביו לחום כלשהו.
   1. מפשירים את ציר הוויטמינים פי 100 במקרר של 4 מעלות צלזיוס או על קרח. ​
      הערה: חלקו מראש את מלאי הוויטמינים ל-10 מ"ל כדי למזער את מספר מחזורי ההקפאה/הפשרה.
   2. הוסף 124.24 מ"ל מים סטריליים לבקבוק הריק של 250 מ"ל.
   3. הוסף 25.76 מ"ל של ציר חומצות אמינו חיוניות פי 50 לתערובת.
   4. הוסף לתערובת 80.14 מ"ל של ציר 100x חומצות אמינו לא חיוניות.
   5. הוסף לתערובת 10 מ"ל של ציר ויטמינים 100x (מופשר).
   6. הוסף 1 מ"ל של מלאי מתכות קורט פי 1000 לתערובת.
   7. מוסיפים לתערובת 8.33 מ"ל של תחליב חלמון 30%.
   8. מוסיפים לתערובת 400 מיקרוליטר של 10 גרם/ליטר ציר פריטין.
   9. מערבבים היטב את התמיסה באמצעות ניעור ידני.
4. מדיום כיח מלאכותי (ASM)
   1. הוסף 250 מ"ל של ASCM לבקבוק 1 ליטר המכיל ASMM.
   2. הוסף 250 מ"ל של ASBM לבקבוק הבינוני.
   3. טרטר את המדיום עם מאגר MOPS בסיסי (1 M) כדי להגיע ל-pH של 6.3 על נייר pH בטווח צר. לפני הטיטרציה, התערובת הבינונית תהיה חומצית מדי.
   4. מקררים את מדיום הליחה המלאכותי שנוצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לסינון.
   5. כדי להתחיל בתהליך הסינון, העבירו 200 מ"ל של מדיום ליחה מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
   6. חבר את מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, הגדר אותה ל-70 מבר ולאחר מכן הנח את החדר על שייקר מסלולי הרועד ב-90 סל"ד בחדר קר ב-4 מעלות צלזיוס.
      1. מלאו 150 מ"ל נוספים של המדיום, מכיוון שכמות ניכרת מסוננת. לוקח 1-2 ימים לסנן 1 ליטר בינוני לחלוטין.
      2. חזור על הפעולה עם תאים נוספים עד לסינון כל המדיה.
         הערה: נסו לא לסנן יותר מ-350 מ"ל של המדיום דרך אותו מסנן של 0.22 מיקרומטר מכיוון שמוצין יחבר את המסנן לאורך זמן.
   7. מקררים מדיום ליחה מלאכותי מסונן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. השתמש ב-ASM תוך חודש מההכנה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

טבלה 1: מתכון למדיום כיח מלאכותי שנגזר מסקירת ספרות. (עמודה 1) ריאגנטים וערכי מפתח בניסוח מדיום כיח מלאכותי. (עמודות 2-7) השוואה בין מתכונים מהספרות הקיימת. (עמודות 8-9).

טור 1		טור 2	טור 3	טור 4	טור 5	טור 6	טור 7	טור 8	טור 9
ערך		קומסטוק	קירשנר	סרירמולו	פאלמר	פלין	גלאגר	לאי	מקור
מוצין		2% w/v	0.5% משקל/נפח	0.5% משקל/נפח	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	פלין
נתרן כלורי		85.5 מ"מ	85.5 מ"מ	85.5 מ"מ	66.6 מ"מ	89.8 מ"מ	85.5 מ"מ	152.3 מ"מ	לפייר
אשלגן כלורי		29.5 מ"מ	29.5 מ"מ	29.5 מ"מ	15.8 מ"מ	-	2.95 מ"מ	15.8 מ"מ	פאלמר
מגנזיום גופרתי		-	-	-	0.6 מ"מ	1 מ"מ	1 מ"מ	0.61 מ"מ	פאלמר
ברזל גופרתי		-	-	-	0.0036 מ"מ	-	-	-	-
אמוניום כלוריד		-	-	-	2.3 מ"מ	60 מ"מ	-	-	-
מונופוטסיום פוספט		-	-	-	2.5 מ"מ	60 מ"מ	-	-	-
גלוקוז		-	-	-	3.2 מ"מ	13 מ"מ	40 מ"מ	0.7 מ"מ	סמביק
לקטט		-	-	-	9 מ"מ	-	-	-	-
חומצות אמינו חיוניות		פי 14.45	0.25 גרם/ליטר	0.25 גרם/ליטר	לכל חומצה	פי 0.5	פי 0.375	פי 1.29	פאלמר
חומצות אמינו לא חיוניות		פי 28.9	0.25 גרם/ליטר	0.25 גרם/ליטר	לכל חומצה	פי 0.25	פי 0.5	פי 8.01	פאלמר
ויטמינים		-	-	-	-	-	1x	1x	גלאגר
קורט מתכות		-	-	-	-	1x	1x	1x	פלין
חלמון ביצה		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	קירשנר
פריטין		0.0003 גרם/ליטר	-	-	-	-	0.0004 גרם/ליטר	0.0004 גרם/ליטר	גלאגר
DNA זרע סלמון		1.4 גרם/ליטר	4 גרם/ליטר	4 גרם/ליטר	-	-	1.4 גרם/ליטר	-	-
DPTA		-	-	0.0059 גרם/ליטר	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	לפייר
אחסון		0	4°	-	-	4°	4°	4°	קירשנר
עיקור		אוטוקלאב	מסנן	אוטוקלאב	-	אוטוקלאב	אוטוקלאב	מסנן	קירשנר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת ויטמינים BME (פי 100)	מיליפורסיגמא	B6891	תמיסה מרוכזת של ויטמינים משלימים.
מלחץ, 30 מ"מ	DWK מדעי החיים	224307	מלחץ להצמדת אטמי אלומיניום לבקבוקי סרום.
D-(+)-גלוקוז	מיליפורסיגמא	G7021	אבקת גלוקוז מוצקה (איזומר דקסטרורוטטורי).
משאבת דיאפרגמה ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	משאבת ואקום לסינון ואקום.
תחליב חלמון ביצה	היימדיה	FD045	תחליב סטרילי של חלמון 30% במי מלח.
פריטין, מופק מטחול סוס	מיליפורסיגמא	F7879	תמיסת פריטין (חלבון אחסון ברזל).
FIREBOY plus מבער בונסן בטיחותי	אינטגרה ביוסיינסס	144000	מבער Bunsen עם ממשק משתמש ותכונות בטיחות.
נייר pH הידריון (1.0–14.0)	מעבדה מיקרו חיונית	94	נייר בדיקת pH לטווח של 1.0-14.0.
נייר pH הידריון (4.0–9.0)	מעבדה מיקרו חיונית	55	נייר בדיקת pH לטווח של 4.0-9.0.
נייר pH הידריון (6.0–8.0)	מעבדה מיקרו חיונית	345	נייר בדיקת pH לטווח של 6.0-8.0.
מכשיר בטיחות היפודרמי Needle-Pro EDGE, 18 גרם	סמיתס מדיקל	401815	מחטי 18 גרם עם מכסי בטיחות.
מד לחץ בשורה	מיליפורסיגמא	20469	מד לחץ גז לניטור לחץ הבקבוק.
Innova 42 שייקר דגירה	אפנדורף	2231000756	אינקובטור משולב / שייקר מסלולי.
מזרק Luer-Lok עם מחט מחוברת	בקטון דיקינסון	309580	שילוב מזרק 3 מ"ל ומחט 18 גרם.
מבחר שסתומי לואר	מכשירי דיוק עולמיים	14011	שסתומים לצינורות זרימת גז.
שייקר מסלולי LSE	תרמו-פישר סיינטיפיק	6780-NP	שייקר מסלולי לערבוב מדיה במהלך הסינון.
מגנזיום גופרתי הפטהידרט	מיליפורסיגמא	M2773	מלח אנגלי מוצק (מגנזיום גופרתי הפטהידרט).
ווסת אוויר רפואי חד שלבי עם מד זרימה	ווסטרן אנטרפרייזס	M1-346-15FM	ווסת קצב זרימת אוויר עם מד 15 ליטר לדקה.
תמיסת חומצות אמינו MEM (פי 50)	מיליפורסיגמא	M5550	תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו חיוניות.
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)	מיליפורסיגמא	M7145	תמיסה מרוכזת של חומצות אמינו לא חיוניות.
מסנן Millex-GP, 0.22 מיקרומטר	מיליפורסיגמא	SLMP25SS	0.22 מיקרומטר מסנן מזרק סטרילי ממברנה פוליאתרסולפון.
Milli-Q אקדמי	מיליפורסיגמא	ZMQS60E01	מערכת סינון מים סטרילית Milli-Q.
מוניטור חמצן MiniOX 3000	MSA	814365	צג אחוז חמצן בזרימת הגז.
מאגר MOPS (1 מ', pH 9.0)	בוסטון ביופרודקטס	BBM-90	מאגר MOPS להתאמת pH של מדיה.
מוצין מקיבת חזיר	מיליפורסיגמא	M2378	אבקת מוצין (חלבון מגליקוזיל היוצר ג'ל).
אשלגן כלורי	מיליפורסיגמא	עמ' 9541	מלח אשלגן כלורי מוצק.
מוטות ערבוב חד פעמיים PTFE	תרמו-פישר סיינטיפיק	14-513-95	מוטות ערבוב מגנטיים חד פעמיים.
PTFE חוט חותם טפלון קלטת	VWR	470042-938	סרט טפלון לחיזוק חיבורי מערכת הגז.
מחסנית טיהור Q-Gard 2	מיליפורסיגמא	QGARD00D2	מחסנית טיהור למערכת Milli-Q.
בקבוקי אחסון מדיה לשימוש חוזר	תרמו-פישר סיינטיפיק	06-423א	בקבוקים לערבוב ואחסון אמצעי תרבות.
פקק גומי, 30 מ"מ, ברומובוטיל אפור	DWK מדעי החיים	224100-331	פקקי גומי לבקבוקי סרום.
בקבוק סרום עם סימונים יצוקים, 500 מ"ל	DWK מדעי החיים	223952	בקבוקי סרום מזכוכית לתרבית אטומה.
סט הרחבת קדח קטן	בראון מדיקל	471960	הארכת צינורות עם מחברי נעילת לואר.
נתרן כלורי	מיליפורסיגמא	S3014	מלח נתרן כלורי מוצק.
תערובת מתכות קורט, פי 1000	תרמו-פישר סיינטיפיק	NC0112668	תמיסה מרוכזת של מתכות קורט פיזיולוגיות.
אטם אלומיניום לא מרופד, 30 מ"מ	DWK מדעי החיים	224187-01	אטמי אלומיניום מכווצים על גבי פקקי גומי.