כימות יחידות יוצרות מושבה של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה

תקציר

מקור: Dodge, R., et al. ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בפורמט צלחת של 96 בארות המיושמת על המיקרוביום של דרוזופילה . J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את הכימות של יחידות יוצרות מושבה (CFUs) של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה באמצעות גישת דילול וציפוי סדרתי. דגימות זבובים הומוגניות המכילות חיידקי מעיים מדוללות באופן סדרתי, מצופות על אגר ומודגרות כדי לאפשר צמיחת מושבה. לאחר מכן מנותחים תמונות של הלוחות באמצעות תוכנה ליישור, פילוח וספירת מושבות בכל נקודה, מה שמאפשר כימות מדויק של CFU.

פרוטוקול

1. הומוגניזציה של זבובים בנפרד בצלחת PCR של 96 בארות

1. הכינו מראש צלחות מקצף חרוזים.
   1. יוצקים חרוזי זכוכית של 0.5 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) על מגש מדידת החרוזים. מורחים את החרוזים על המגש כך שכל הבארות יהיו מלאות ומפולסות, ולאחר מכן מברישים עודפי חרוזים לצינור חרוטי כדי לשחזר אותם.
   2. הנח צלחת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם חצאית למחצה (ראה טבלת חומרים) הפוכה על מגש המדידה ויישר אותה עם הבארות על ידי התאמתה לשקע במגש. לאחר מכן, הפוך אותו במהירות כדי להעביר את החרוזים.
   3. הסר עודפי חרוזים ממשטח צלחת ה-PCR וכסה אותו בנייר כסף. בדוק את לוחית ה-PCR כדי לוודא שכל הבארות מכילות חרוזים. השתמש בכף שקילה במידת הצורך כדי להוסיף חרוזים לבאר אחת. אם חשמל סטטי גורם לחרוזים להידבק על משטחי הצלחת, נגב או רסס את החלק האחורי של מגש המדידה וצלחת ה-PCR ב-70% אתנול.
   4. מכסים בנייר אלומיניום. ניתן להכין צלחות רבות בדרך זו ולאחר מכן לבצע חיטוי ולאחסן לשימוש מאוחר יותר. כאשר הוא מוכן לשימוש, הוסף 100 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל באר באמצעות פיפטור 96 ערוצים (ראה טבלת חומרים).
2. עיקור פני השטח של הזבובים המתיישבים בחיידקים עם 70% אתנול לפני הומוגניזציה.
   1. הרדמו את הזבובים עם 100% CO₂ למשך 5 שניות. העבירו זבובים מורדמים מהבקבוקון לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות משפך קטן (איור 1A-2). במחקר זה, נוספו בדרך כלל 25 זבובים לכל צינור.
   2. יש לרסס מיד ~1 מ"ל של 70% אתנול לתוך הצינור, לסגור את הצינור ולערבב בהיפוך למשך 10 שניות. לאחר מכן, שאפו את האתנול עם פיפטה P1000, והקפידו לא לשאוב זבובים. חזור על הפעולה שוב עם אתנול, ואז פעמיים עם PBS סטרילי (איור 1A-3).
3. לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, סגור את הצינור, וכשצד המכסה כלפי מטה, הקש עליו בחוזקה כמה פעמים על הספסל כך שהזבובים ייכנסו למכסה.
4. פתחו את הצינור והוציאו זבובים לתוך הבארות באמצעות מלקחיים (איור 1A-4). הניחו זבוב אחד בכל באר (איור 1A-5). שמור את הצלחת על קרח בזמן הטעינה כדי לשמור על הזבובים מורדמים.
5. אטום את הצלחת באמצעות רדיד איטום חום של Thermal Bond (ראה טבלת החומרים).
   1. ראשית, הסר את כל החרוזים התועים הקרובים לבארות, מכיוון שאלו עלולים לגרום לדליפה באטם נייר הכסף. ודא שהצד העמום של נייר הכסף מכוון כלפי מטה על הצלחת והצד המבריק כלפי מעלה לכיוון אוטם החום. לחץ על אוטם החום (ראה טבלת החומרים) כלפי מטה בחוזקה למשך 5 שניות (איור 1A-6). מבריקים עם המוליך הידני (ראה טבלת חומרים) כדי לאבטח את נייר הכסף.
      הערה: איטום לקוי הוא גורם לאובדן דגימה.
6. אבטח את הצלחת בשייקר הצלחת. הומוגניזציה למשך 5 דקות (איור 1A-7). סובב את לוחית החרוזים למשך 30 שניות בספינר מיני צלחת (ראה טבלת חומרים) ב-350 x גרם כדי להסיר נוזל מנייר האיטום.
7. הסר את נייר הכסף תוך כדי החזקת הצלחת כדי לא להתיז טיפות זבוב הומוגניות מהבארות.

2. דילול סדרתי של הומוגנאט זבוב ואיתור על לוחות CFU

1. הנח ארבע צלחות גידול אגר מלבניות של דה מאן, רוגוסה ושארפ (MRS) (ראה טבלת חומרים) בארון הבטיחות הביולוגית והסר את מכסיהן. בפרוטוקול זה, אגר MRS שימש לגידול L . plantarum. השאירו את הצלחות הללו לייבוש לפחות 10 דקות (20 דקות אם הן נשפכו טריות או קרות מהאחסון).
   הערה: אם הצלחות רטובות, הטיפות מצלחת 96 הבארות ירוצו יחד ויהרסו את הספירה.
2. הכן שלוש לוחות דילול על ידי הוספת 100 מיקרוליטר PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות באמצעות פיפטור בן 96 ערוצים. טען מתלה של קצות P20 על הפיפטור בן 96 הערוצים.
3. בצע דילול של 1:10 על ידי שאיבת 11.1 מיקרוליטר של הומוגנאט מלוח הדגימה שהוכן בסעיף 1 (איור 1A-8). הקפידו לשאוב מאמצע הבארות ולא מתחתית הבארות מכיוון שהזבוב הומוגני וחרוזי הזכוכית יסתמו את הפיפטות. החרוזים שוקעים, וחלקיקי הזבוב צפים, ומשאירים את השכבה האמצעית צלולה ברובה.
4. הוצא את ה-11.1 מיקרוליטר לתוך צלחת הדילול הראשונה, שכבר מכילה 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לבאר. שמור את צלחת הדילול על שייקר הצלחת למשך 10 שניות ב-600 סיבובים לדקה (סל"ד). מערבבים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במשך חמישה מחזורים. העבירו 11.1 מיקרוליטר מלוח הדילול הראשון לצלחת הדילול השנייה, וחזרו על שלבי הערבוב עבור שתי לוחות הדילול הבאים.
5. בצע ציפוי סדרת דילול כמתואר להלן.
   1. אחזר את לוחות הגידול מארון הבטיחות הביולוגית.
   2. החל מהצלחת המדוללת ביותר, אתר 2 מיקרוליטר מכל באר על לוחות האגר באמצעות פיפטור 96 בארות (איור 1A-9).
      1. הורד את ראש הפיפטור לאט על הצלחת, הקפד לא לדקור באגר. בדוק את הצלחת בזהירות וודא שכל הכתמים חולקו; אם לא, הוסף ידנית 2 מיקרוליטר למיקום המתאים. בדוק שהכתמים הנוזליים נספגים במהירות באגר ואינם רצים יחד.
      2. אם הכתמים רצים יחד, יבש סט חדש של צלחות אגר טריות לתקופה ארוכה יותר ובצע מחדש את האיתור. אם ישנם מספר סוגי צלחות (למשל, מדיה שונה או עם אנטיביוטיקה), זהה גם אותם. יש להוציא את כל התמיסה שנותרה בחזרה לתוך צלחת הדילול ולהמשיך לריכוז הגבוה הבא.
         הערה: בעת איתור דילול, מערבבים את הדילול הבא חמש פעמים כדי להבטיח שתכולת קצות הפיפטה מנוקה מהדילול הקודם. ניתן לאחסן את לוחות הדילול למשך >8 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מבלי להשפיע על ספירת המושבות.
6. חזור על תהליך הציפוי כמתואר בשלב 2.5 עבור לוחות הדילול הנותרים, והתקדם מהדילול ביותר למרוכז ביותר עד לצלחת עם ההומוגנאט המקורי.
7. כאשר כל הנוזל נספג לתוך האגר, הפכו את הצלחות והניחו אותן באינקובטור (איור 1A-10). עבור Lactiplantibacillus ו-Acetobacter מדרוזופילה, הטמפרטורה האופטימלית היא 30 מעלות צלזיוס במדיה MRS. דגירה עד שהמושבות מגיעות לגודל אופטימלי: המושבות גדולות מספיק כדי לראות אותן בבירור, אך לא גדולות עד כדי כך שהן מתמזגות או מפריעות זו לגדילה של זו (ראו את התוצאות המייצגות לכימות הגודל האופטימלי).
   הערה: תנאי הגידול האופטימליים תלויים במתח ויש לקבוע אותם באופן אמפירי. עבור Lactiplantibacillus מדרוזופילה, זמן הדגירה האופטימלי הוא 26 שעות עד 30 שעות על MRS agar. עבור אצטובקטר מדרוזופילה, זמן הדגירה האופטימלי הוא 30 שעות עד 48 שעות ב-MRS, תלוי בזן.
8. לאחר הדגירה יש לאחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך עד שהן מוכנות לספירה.

3. כימות יחידות יוצרות מושבה (CFUs)

1. כמת CFUs על ידי צילום הלוחות ולאחר מכן ספירת המושבות באמצעות תוכנה אוטומטית, כמפורט להלן. אם הצלחות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תחילה אפשר להן להגיע לטמפרטורת החדר כך שלא יהיה עיבוי על הצלחות, מה שמייצר סנוור.
2. ארגנו את הלוחות ברצף הגיוני ושמרו אותם בסדר הזה בזמן הצילום - כך יהיה קל יותר לתת שמות לקבצים. כוון את כל הלוחות כך ש- A1 יהיה בפינה השמאלית העליונה עבור כל הלוחות. מומלץ לתייג את פינת A1 עם מזהה ייחודי כדי להבטיח שלא יהיה ערבוב של התמונות. ערמו כל סדרת דילול לפי הסדר.
3. הסר את מכסה הצלחת והנח את הצלחת על ה-stagה, כשה-A1 מכוון בפינה הנכונה. קופסת הצילום של הלוח מותאמת לצילום לוחות מגש אלה וכוללת אפשרויות תאורה וסינון לתמונת מושבות פלואורסצנט.
4. דמיינו את הצלחות. השתמש במצלמה (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות ידניות כדי להשיג רמת חשיפה עקבית בין הלוחות. מומלץ להגדיר אורך מוקד ארוך כדי למזער את עיוות הפרספקטיבה. צלם את התמונה באמצעות תריס מרוחק כדי למזער את הטשטוש כתוצאה מרעידות המצלמה.
5. העבירו את התמונות למחשב ושנו את שמותיהם, כולל שם הניסוי, סוג המדיה, גורם הדילול וכל פרט רלוונטי אחר. מערכות הפעלה מסוימות (ראה טבלת חומרים) כוללות תכונה שימושית לשינוי שם אצווה ב-Finder על ידי לחיצה ימנית על מבחר קבצים.

4. ספירת מושבות אוטומטית באמצעות חבילת Count-On-It

1. חתוך את התמונות באמצעות התוסף Croptacular המצורף עבור ImageJ. תוסף זה עוזר לחלק את התמונה למערך מסודר של תת-אזורים (למשל, 8 x 12 עבור צלחת של 96 בארות). תת-האזורים ייספרו בנפרד.
   1. ארגן את התמונות לעיבוד לכימות בתיקיה. בחר שמות קבצים המבדילים בין הלוחות, מכיוון ששמות קבצים אלה הופכים לכותרות עמודות לכל קבוצת ספירות. בתוך תיקיה זו, צור תיקיות משנה בשם "חתוך" ו"קבלות".
   2. הפעל את Croptacular ולחץ על אישור כדי להתחיל לחתוך.
      הערה: הגדרות ברירת המחדל מוצגות ובדרך כלל מספיקות. בהתאם לרזולוציה של התמונה, התאורה, גודל הספוט וכו', זה יכול להיות מועיל להתאים את פרמטרי הבסיס.
   3. אם התמונה כבר ישרה, פשוט לחץ על רווח. אחרת, יישר את התמונה על-ידי ציור קו לאורך קצה שאמור להפוך לאופקי. צייר מחדש את הקו כמה פעמים שצריך אם התמונה עדיין לא נראית מיושרת.
   4. לאחר מכן, צייר תיבת גבול של האזור שעבורו יש לבצע ספירה. התאימו את הגודל והפרופורציה עד שכל הכתמים יהיו בתוך התאים שלהם. גרור את הסמן אל מחוץ לתיבת הגבול כדי לרענן את הרשת. כאשר הרשת נראית טוב, הקש על רווח.
   5. ודא שהתמונה הבאה מסתובבת אוטומטית לאותה זווית כמו הראשונה. התוסף מניח שכל התמונות מיושרות אותו הדבר. אם זה מדויק, לחץ על רווח כדי להמשיך. אחרת, יישר את התמונה כמו קודם. הרשת גם זוכרת את אותו מיקום כמו התמונה הקודמת; התאם במידת הצורך ולאחר מכן הקש על רווח.
2. ספר את המושבות על הלוחות באמצעות התוסף Count-On-It: Gridiron המצורף עבור ImageJ.
   1. השיק את Count-On-It >-Gridiron. השתמש באותן הגדרות רשת כמו ב- Croptacular. משתמשים יכולים לקבץ תיקייה שלמה, לנתח תמונה בודדת או להתחיל מהתמונה הנוכחית.
   2. הגדר את הסף על סמך ערך עוצמת פיקסלים עליון ותחתון. הפוך את הסף למחמיר ככל האפשר תוך בחירת כל המושבות. באופן אידיאלי, יהיה מרווח מסוים בין המושבות שנבחרו, אך התוכנה מסוגלת לפלח את הכתמים במידה מסוימת. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח "נדרשת פעולה" כאשר הסף משביע רצון.
   3. כדי לבדוק את התוצאות, התקרב והסתכל מקרוב יותר על ספירת המושבות. לחיצה על ביטול תבטל את התוסף. לחץ על אישור כדי להמשיך.
   4. בתמונה הראשונה, ודא שניתנת האפשרות להמשיך או לחזור לתפריט ההגדרות, למשלample, לשנות את גודל המושבה המינימלי. כדי להמשיך בתהליך האצווה, לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תיקיה לשמירת הקבלות וטבלת התוצאות. השתמש בתיקיית "קבלות" או צור תיקיה חדשה.
   5. לאחר התמונה הראשונה, התמונות הבאות יוגדרו כברירת מחדל לאותו סף כמו ההגדרות הקודמות. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות אלה או להתאים את ההגדרות. אם התמונות עקביות וההגדרה מדויקת, לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח "נדרשת פעולה".
      הערה: לאחר השלמת כל התמונות באצווה, טבלת התוצאות נשמרת אוטומטית באותה תיקייה כמו הקבלות.
   6. סקור את קבלות הספירה המופקות על ידי התוכנה ותקן ידנית שגיאות ספירה. התוסף ImageJ מדויק מבחינה סטטיסטית, אך מתרחשות שגיאות. הוכחת הקבלות כדי לבחון חריגים ולזהות טעויות בספירה. התוכנה שומרת את נתוני ה-CFU כקובץ .csv באותה תיקייה כמו הקבלות.
3. נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המועדפת על המשתמש.

תוצאות

איור 1: מבחן הקולוניזציה מודד CFUs במאות זבובים בודדים באמצעות פורמט צלחת של 96 בארות. (A) סקירה ציורית של בדיקת הקולוניזציה ושיטת הכימות בתפוקה גבוהה המשמשת כמתואר בסעיף הפרוטוקול. (B) שכיחות Lactiplantiba...

חומרים