טיפול בחיידקים עם הפרשות שורש צמחים לחיקוי אינטראקציות בין צמח לחיידקים במבחנה

תקציר

מקור: Yi, Y., et al. אינטראקציה בין צמח למיקרוב: תגובת שעתוק של Bacillus Mycoides להפרשות שורש תפוחי אדמה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההכנה והטיפול בתרביות Bacillus mycoides כדי לחקור אינטראקציות בין צמח לחיידקים. הוא מתאר את השלבים מפסים של תרבית מלאי ודגירה שלה במדיום נוזלי ועד לחשיפת החיידקים להפרשות שורש צמחים תחת תסיסה. התהליך מגיע לשיאו בקציר והקפאת בזק של תאי החיידקים לניתוח עוקב של שינויים בביטוי הגנים הנגרמים על ידי ההפרשות.

פרוטוקול

1. גידול חיידקים

1. פס זן B. mycoides ממאגר גליצרול של -80 מעלות צלזיוס על צלחת אגר לוריא-ברטאני (LB), ודגירה על הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. לחסן מדיום נוזלי LB עם מושבה אחת מהצלחת, ולגדל את התרבות בחממה רועדת ב -200 סל"ד בן לילה
30 מעלות צלזיוס.

2. טיפול ודיגום חיידקים

1. כדי להשוות את עקומת הצמיחה של החיידקים שטופלו בהפרשות שורש לבקרה שלילית, הכינו סדרה של צלוחיות המכילות 50 מ"ל של מדיום נוזלי LB. הוסף 0.5 מ"ל מתרבית חיידקי הלילה לכל הצלוחות, והוסף 0%, 5%, 10% או 15% (v/v) הפרשות שורש או מים סטריליים נטולי יונים למדיום, בהתאמה.

2. השתמש בתרבית עם מים נטולי יונים במקום הפרשות שורש כבקרה. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) כל שעה לאחר מכן. צור עקומת צמיחה על ידי התוויית ערכי OD₆₀₀ לעומת זמן.

3. לדלל תרבית B. mycoides למשך הלילה עם 90 מ"ל של מדיום LB מחומם מראש ל-OD₆₀₀ ראשוני של ~ 0.05 בבקבוק של 300 מ"ל. הוסף לתרבית 10 מ"ל הפרשות שורש ודגר אותה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה.

4. השתמש בטיפול במים סטריליים דה-יונים של 10 מ"ל כבקרה. אוספים תאים מהתרבית על ידי צנטריפוגה ב-9,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זורקים את הסופרנטנט, ומיד מקפיאים את הגלולה בחנקן נוזלי, ואז מאחסנים אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן היפוכלוריט	סיגמא	CAS: 7681-52-9	10-15% כלור פעיל
מרק לוריא-ברטאני (LB)
אינקובטר	ניו ברונסוויק סיינטיפיק	אינובה 4000
ספקטרופוטומטר	תרמו פישר סיינטיפיק	ג'נסיס 20
חנקן נוזלי
חרוזי זכוכית	סיגמא	G8893	0.5 מיקרומטר
צינור 2.0 מ"ל עם מכסה בורג			ללא RNase
שפופרת אפנדורף 1.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל			ללא RNase
צנטריפוגה	אפנדורף	5430