בדיקת גידול חיידקים מוגבלת מתכת לחקר תפקידם של גנים המגיבים למתכת

תקציר

מקור: Maurakis, S., et al. גידול מוגבל במתכת של Neisseria gonorrhoeae לאפיון גנים המגיבים למתכת ורכישת מתכת מליגנדים מארחים. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים בדיקת גידול חיידקים מוגבלת מתכת כדי לחקור את תפקידם של גנים המגיבים למתכת. חיידקים מסוג בר ומוטנטיים הגדלים במדיום מדולדל מתכת מודגרים עם ליגנד מתכת, וצמיחתם מנוטרת באמצעות קורא צלחות. בתנאים מדוללי מתכת, החיידקים מסוג הבר מבטאים קולטן פני השטח המאפשר קליטה וצמיחה של מתכות, בעוד שהמוטנט חסר קולטן זה, וכתוצאה מכך צמיחה מוגבלת.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות מלאי מדיום מוגדר (CDM) שטופלו על ידי Chelex

1. פתרון מלאי I
   1. שלבו נתרן כלורי או NaCl (233.8 גרם), אשלגן גופרתי או K₂SO₄ (40.0 גרם), אמוניום כלורי או NH₄Cl (8.8 גרם), דו-אשלגן מימן פוספט או K₂HPO₄ (13.9 גרם), ומונופוטסיום דימימן פוספט או KH₂PO₄ (10.9 גרם) במים נטולי יונים לנפח סופי של 1 ליטר.
   2. יש לעקר את התמיסה בפילטר ולהכניס אותה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. פתרון מלאי II
   1. שלבו תיאמין חומצה הידרוכלורית או HCl (0.2 גרם), תיאמין פירופוספט-Cl (0.05 גרם), סידן פנטותנט (0.19 גרם) וביוטין (0.3 גרם) באתנול 50% (נפח/נפח) לנפח סופי של 1 ליטר.
   2. מכניסים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. פתרון מלאי III
   1. קומביין L-אספרטט (4.0 גרם), L-גלוטמט (10.4 גרם), L-ארגינין (1.2 גרם), גליצין (0.2 גרם), L-סרין (0.4 גרם), L-לאוצין (0.72 גרם), L-איזולאוצין (0.24 גרם), L-ולין (0.48 גרם), L-טירוזין (0.56 גרם), L-פרולין (0.4 גרם), L-טריפטופן (0.64 גרם), L-תראונין (0.4 גרם), L-פנילאלנין (0.2 גרם), L-אספרגין-H₂O (0.2 גרם), L-גלוטמין (0.4 גרם), L-היסטידין-HCl (0.2 גרם), L-מתיונין (0.12 גרם), L-אלנין (0.8 גרם), L-ליזין (0.4 גרם), וגלוטתיון מחוזר (0.36 גרם) ב-500 מ"ל מים נטולי יונים.
   2. ממיסים L-ציסטאין (0.44 גרם) ו-L-ציסטין (0.28 גרם) בנפח מינימלי (~1 מ"ל) של 1 M HCl ומוסיפים לתמיסת חומצות האמינו הנ"ל.
   3. התאם את ה-pH של התמיסה עם 10 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) עד להמסת כל החלקיקים. ה-pH הסופי יהיה 10.0-11.0.
   4. הביאו את הנפח הסופי ל -1 ליטר עם מים נטולי יונים.
   5. יש לעקר את התמיסה במסנן ולחלק אותה לנפחים של 250 מ"ל.
   6. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. פתרון מלאי IV
   1. ממיסים גלוקוז (200 גרם) במים נטולי יונים לנפח סופי של 1 ליטר.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לחמם את התמיסה כדי להמיס את הגלוקוז.
   2. מסננים ומכניסים את התמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
5. פתרון מלאי V
   1. שלב היפוקסנטין (5.0 גרם), אורציל (5.0 גרם) ו-NaOH (4.0 גרם) במים נטולי יונים לנפח סופי של 1 ליטר.
   2. מסננים, מעקרים ומכניסים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
6. פתרון VI
   1. הכן תמיסת סידן כלוריד דיהידרט 1 M או CaCl_{2-2H 2}O (147 גרם/ליטר) במים נטולי יונים. מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורת החדר (RT).
7. פתרון מלאי VII
   1. הכינו תמיסת מגנזיום גופרתי נטולת מים (MgSO₄) של 1 M במים נטולי יונים. מסננים, מעקרים ומאחסנים ב-RT.
8. פתרון מלאי VIII
   1. הכן תמיסת נתרן ביקרבונט 1 M (NaHCO₃) במים נטולי יונים. מסננים, מעקרים ומאחסנים ב-RT.

2. הכנת תרכיז סטרילי פי 4 ו-CDM 1x

הערה: הליך זה אמור להתבצע בכלי זכוכית סטריליים שטופלו בחומצה או בפלסטיק כדי למנוע שטיפת מתכות לתמיסות.

1. שלב תמיסות מלאי I (50 מ"ל), II (20 מ"ל), III (250 מ"ל), IV (50 מ"ל) ו-V (20 מ"ל) עם 20.0 גרם של 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) וערבב לערבוב.
2. התאם את ה-pH ל-7.4, ולאחר מכן הביא את הנפח הסופי ל-500 מ"ל עם מים נטולי יונים.
3. שטפו את שרף Chelex-100 ב-1 ליטר מים נטולי יונים כדי להסיר חומרים משמרים לפני הוספתו לתרכיז הסטרילי פי 4. עשה זאת על ידי הוספת 50 גרם שרף ל-1 ליטר מים נטולי יונים וערבוב במשך שעה לפחות. הסר את המים על ידי סינון ואקום והשתמש בשרף שטוף זה לשלב 2.4.
4. מוסיפים 50 גרם שרף ומערבבים לאט במשך 90 דקות בדיוק.
5. הסר שרף על ידי עיקור מסנן ואחסן את התרכיז הסטרילי פי 4 ב-4 מעלות צלזיוס.
6. כדי להכין ריכוז עבודה 1x של CDM, תחילה יש לדלל את תרכיז ה-4x במים נטולי יונים סטריליים, ולאחר מכן להוסיף תמיסה VI (125 מיקרוליטר לכל 500 מ"ל של תמיסה 1x), תמיסה VII (535 מיקרוליטר לכל 500 מ"ל) ותמיסה VIII (10 מ"ל לכל 500 מ"ל).
   הערה: למרות שכל פתרונות המלאי כבר עוקרו, מומלץ לעקר שוב את תמיסת ה-1x לאחר ההכנה.

3. הכנת לוחות CDM

הערה: המתכון שלהלן מכין 1 ליטר מדיה לצלחות, אך עדיף להכין אותם בנפחים קטנים יותר. הכל מצטמצם באופן פרופורציונלי.

1. אגרוז שטוף
   1. ממיסים 50 גרם אגרוז בליטר מים נטולי יונים, תוך ערבוב למשך שעה.
   2. העבירו את התמיסה לבקבוק צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-1,200 x גרם למשך 15 דקות ב-RT. שפכו בזהירות את הסופרנטנט והשליכו.
   3. הוסף מספיק מים נטולי יונים כדי להשעות מחדש את כדור האגרוז, ולאחר מכן העביר לבקבוק של 1 ליטר. מביאים לנפח סופי של 1 ליטר עם מים נטולי יונים ואז מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2. השליכו את הסופרנטנט.
   4. הוסף מספיק 100% אתנול כדי להשעות מחדש את הגלולה, ולאחר מכן העביר לבקבוק חדש של 1 ליטר. מביאים לנפח סופי של 1 ליטר עם אתנול. מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
   5. חזור על שלב 3.1.4.
   6. הוסף מתנול לכדור האגרוז לתלייה, ואז העביר לבקבוק של 1 ליטר. מביאים לנפח סופי של 1 ליטר עם מתנול. מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
   7. חזור על שלב 3.1.6.
   8. מעבירים את האגרוז השטוף למגש מרופד בנייר אלומיניום ומניחים לייבוש במכסה אדים. כשהוא יבש, העבירו לכלי נטול מתכת לאחסון לטווח הארוך.
2. מוסיפים 10 גרם אגרוז שטוף ו -5 גרם עמילן תפוחי אדמה ל -750 מ"ל מים נטולי יונים.
3. חיטוי למשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס, 100 kPa מעל לחץ אטמוספרי.
4. הניחו למדיה להתקרר ל-~65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו 250 מ"ל של 4X CDM, 250 מיקרוליטר של תמיסה VI, 1.07 מ"ל של תמיסה VII ו-20 מ"ל של תמיסה VIII.
5. אם תרצה, הוסף את המתכות לבחירתך לפני ששופכים צלחות. תוספת של כלאטורים אינה הכרחית כדי לשמור על תנאים נטולי מתכת.
6. יוצקים לצלחות פטרי ומניחים להתמצק.

4. גידול מוגבל במתכת של Neisseria gonorrhoeae

הערה: עבור רוב היישומים, אין צורך להלחיץ את החיידקים לפני חיסון CDM. שלב ההכפלה הראשוני ב-CDM והדילול שלאחר מכן מספיקים כדי לרוקן את הגונוקוקים ממאגרי הברזל והאבץ הפנימיים שלהם. ככזה, שני השלבים הראשונים של ההליך הבא מבוצעים באמצעות לוחות אגר העשויים מבסיס בינוני של גונוקוקוס (GC) שנוספו לתוסף I של קלוג ו-12.5 מיקרומטר ברזל חנקתי (Fe(NO₃)₃). אם רוצים מתח מתכת מוקדם, אנו ממליצים להכין לוחות בסיס בינוניים GC ללא Fe (NO₃) ₃ ועם 5 מיקרומטר TPEN (n,n,n',n'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) לכלציה של אבץ או 10 מיקרומטר דפרוקסאמין לכלציה של ברזל. כל הדגירה מתבצעת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.

1. יומיים לפני הניסוי, ביום השני, פסו גונוקוקים ממקפיא על צלחות בינוניות של GC ודגרו לא יותר מ-24 שעות.
2. ביום -1, פס מושבות בודדות על צלחות בינוניות GC טריות. נסו לעשות זאת 14-16 שעות לפני ניסוי הגדילה.
3. ביום הניסוי, הוסף 5-10 מ"ל 1x CDM לבקבוק זרוע צד מבולבל שטוף חומצה של 125 מ"ל והשתמש בו כדי לרוקן קולורימטר קלט.
4. השתמש במקלון סטרילי עם קצה כותנה כדי לחסן CDM ממושבות בריאות ובודדות. כוונו ל-20 יחידות קלט.
   הערה: אם מד צבע של קלט אינו זמין, ספקטרופוטומטר מתאים גם כן. אין נוסחת המרה אוניברסלית ליחידות קלט ל-OD, אך מדריך גס זמין (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. דגירה עם ניעור ב-250 סל"ד עד להכפלת מסה אחת בערך (40 יחידות קלט). זה אמור לקחת בין 1-2 שעות.
6. בשלב זה, התרביות מדוללות בחזרה על ידי הוספת נפח מספיק של CDM כדי להגיע למחצית מצפיפות התרבית הראשונית (למשל, אם 5 מ"ל של תרבית ירדו מ-20 ל-40 יחידות קלט, 15 מ"ל של CDM יחזירו אותה ל-10 יחידות קלט), והצמיחה תימשך כמו בשלב 4.5. הכמות הספציפית של דילול גב, טיפולי מתכת וכו', תלויה ביישומים במורד הזרם. להלן שלוש דוגמאות

5. מבחני צמיחה מוגבלים במתכת

הערה: מבחנים אלה מתארים תערובות צמיחה מוכנות מראש. הכנת תערובות אלו מתוארת בסעיף 6.

1. במהלך הכפלת המסה בשלב 4.5, טפל מראש בבארות של מיקרופלייט בן 96 בארות עם תערובות מוקדמות פי 10. בנוסף, ייעד שלוש בארות שישמשו כחסר. לבארות אלה, הוסף 10 מיקרוליטר של 10x premix ו-90 μL של CDM.
2. לאחר שהתרביות בצלוחיות זרוע הצד הוכפלו, הוסף 100 מיקרוליטר מכל תרבית לבאר שאינה בשימוש במיקרו-לוח ומדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600). ניתן לעשות זאת עם קובטות בספקטרופוטומטר, אך עם מספר גדול יותר של זנים בבדיקה, זה יכול להיות מסורבל ובדרך כלל לא מומלץ אלא אם כן הספקטרופוטומטר שלך יכול למדוד ישירות מהזרוע של בקבוק הזרוע הצדדית.
   1. בזמן מדידת ה-OD, הנח את הצלוחיות בחזרה באינקובטור כדי להבטיח שהגונוקוקים יישארו ברי קיימא.
3. חשב את כמות הדילול הנכונה הנדרשת כדי להביא את התרביות ל-OD600 = 0.02. ל-10x premixes יש השפעה זניחה על OD וניתן להשמיט אותם מהחישוב.
4. מדללים תרביות עם CDM בצינורות תרבית קטנים ומוסיפים נפח מספיק כדי לדלל את התערובות המוקדמות פי 10 ל-1x בצלחת. אם יש מחמם צלחות, שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס בזמן העבודה.
5. דגרו את הצלחת למשך 8-12 שעות עם טלטול בקורא צלחות, תוך ביצוע מדידות OD600 במרווחי זמן רצויים.

6. העמסת מתכת של טרנספרין, S100A7 וקלפרוטקטין, והכנת 10x premixes

הערה: כמו בהכנת CDM, השתמש בזכוכית או פלסטיק שטופים בחומצה להכנת תמיסה.

1. ממיסים טרנספרין אנושי ב-10 מ"ג/מ"ל (125 מיקרומטר) במאגר הראשוני (100 מ"מ Tris, 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ NaHCO₃, pH = 8.4). S100A7 וקלפרוטקטין תלויים במאגר המורכב מ-20 מ"מ טריס, 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ 2-מרקפטואתנול ו-1 מ"מ סידן כלורי או CaCl₂, pH = 8.0).
   1. הוסף תמיסת תסיסה (100 מ"מ נתרן ציטראט, 100 מ"מ NaHCO₃, 5 מ"מ ברזל (III) כלוריד הקסהידרט או FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8.4) לתמיסת הטרנספרין כדי להשיג רוויה של 30% ברזל (למשל, 75 מיקרוליטר של תמיסת תסיסה מתאימה ל-5 מ"ל של טרנספרין אם היא מיוצרת ב-10 מ"ג/מ"ל).
   2. הוסיפו אבץ גופרתי (ZnSO₄) ל-S100A7 או קלפרוטקטין ביחס מולארי של 50% לחלבון כדי ליצור רוויה של 25% (לכל מולקולת חלבון יש שני אתרי קשירה של מתכת). ניתן להשתמש בתכשירים של 100 מיקרומטר S100A7 או קלפרוטקטין עם 50 מיקרומטר ZnSO₄ .
   3. בשני המקרים, אפשר ערבוב מקצה לקצה למשך שעה לפחות להעמסת מתכת.
2. הכן 4 ליטר של מאגר דיאליזה (40 מ"מ Tris, 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ NaHCO₃, pH = 7.4). פצלו את זה לשני נפחים נפרדים של 2 ליטר והניחו אחד ב-4 מעלות צלזיוס.
3. הוסף את החלבונים העמוסים במתכת לקלטת דיאליזה באמצעות מזרק ודיאליזה כנגד נפח המאגר הראשון למשך 4 שעות ב-RT.
4. העבר את הקסטה לנפח המאגר השני ודיאליזה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שלבים אלה, יש להסיר את כל המתכות הלא קשורות.
   הערה: אנו ממליצים על בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית כדי לקבוע את ריכוזי החלבון לאחר דיאליזה.
5. השתמש בתערובת מוקדמת של טרנספרין פי 10 לניצול טרנספרין כמקור ברזל יחיד.
   1. הכן את התערובת המוקדמת הזו על ידי דילול 30% Fe-transferrin אנושי ואפו-טרנספרין בקר (מוכן ב-125 מיקרומטר כמתואר עבור טרנספרין אנושי, ללא שלב העמסת הברזל) ל-75 מיקרומטר ו-30 מיקרומטר, בהתאמה, בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). תערובת בקרה חיובית מחליפה 30% Fe-transferrin ב-75 מיקרומטר Fe(NO)₃, ותערובת בקרה שלילית משמיטה כל תוספת ברזל, ושומרת רק על אפו-טרנספרין בקר. בבדיקת הגידול, יש לדלל 10 מיקרוליטר מהתרכיזים הללו עם 90 מיקרוליטר תרבית. הריכוזים הסופיים הם 7.5 מיקרומטר 30% Fe-transferrin אנושי ו-3 מיקרומטר אפו-טרנספרין בקר.
6. השתמש בגרסה שונה של טרנספרין 10x premix עבור ניצול S100A7 או קלפרוטקטין כמקור אבץ יחיד.
   1. לקבלת תערובת בקרה חיובית, שלבו 50 מיקרומטר ZnSO₄ בתערובת הפרה-טרנספרין. לבקרה שלילית, שלב 50 מיקרומטר TPEN והשמיט את האבץ. לאחר מכן, קחו 10 מיקרוליטר מכל אחד מאלה עבור כל דגימה נחוצה, והעבירו את הנפח הזה לצינור חדש. הוסף לזה חצי נפח של PBS סטרילי. לדוגמה, אם 10 בארות יקבלו את תערובת הבקרה החיובית, קחו 100 מיקרוליטר של תערובת מוקדמת, העבירו אותה לצינור חדש והוסיפו 50 מיקרוליטר PBS. עשו את אותו הדבר עבור השליטה השלילית.
   2. כדי להכין את תערובת S100A7 או קלפרוטקטין מראש, קח 10 מיקרוליטר מתערובת הבקרה השלילית לכל באר נדרשת, עבור לצינור חדש והוסף מחצית מהנפח הזה של 25% Zn-S100A7 או קלפרוטקטין. בבדיקת הגידול, השתמש ב -15 מיקרוליטר של תערובת מוקדמת ודלל עם 85 מיקרוליטר תרבית. הריכוזים הסופיים של הטרנספרינים נשארים זהים לשלב 8.5, עם תוספת של 5 מיקרומטר של Zn, TPEN או S100A7/calprotectin.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלוחיות זרוע צד 125 מ"ל	בלקו	ברקוד 2578-S0030	יש להזמין בהתאמה אישית
2-מרקפטואתנול	VWR	M131	פתח במכסה אדים
נייר 3 מ"מ	בריאות מהונדסת גנטית	3030-6461	נקרא "נייר סינון" בטקסט
אגרוז	ביולון	ביו-41025	אבקה
אמוניום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	א9434	אבקה
טרנספרין בקר	סיגמא-אולדריץ'	T1428	אבקה
סידן כלוריד דיהידראט	סיגמא-אולדריץ'	C5080	אבקה
סידן פנטותנט	סיגמא-אולדריץ'	C8731	אבקה
קלפרוטקטין	לא ישים	לא ישים	זה מסופק לנו על ידי משתף פעולה
שרף Chelex-100	ביו-ראד	142-2832	יש לשטוף במים נטולי יונים לפני השימוש
ספוגית סטרילית עם קצה כותנה	פוריטני	25-806	כותנה טובה יותר מפוליאסטר ליישום זה
דפרוקסאמין	סיגמא-אולדריץ'	D9533	אבקה
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	אבקה
קלטת דיאליזה	תרמו	66380	יש להשרות מראש במאגר לפני השימוש
אתנול	קופטק	V1016	נוזל דליק, יש לאחסן בארון דליקים
כלוריד ברזל	סיגמא-אולדריץ'	F7134	מגרה, לא לשאוף
ברזל חנקתי nonahydrate	סיגמא-אולדריץ'	F1143	מגרה, לא לשאוף
בסיס בינוני GC	דיפקו	228950	אבקה, כבר מכילה אגר
גליצין	סיגמא-אולדריץ'	G8898	אבקה
הפס	פישר	L-15694	אבקה
טרנספרין אנושי	סיגמא-אולדריץ'	T2030	אבקה
היפוקסנטין	סיגמא-אולדריץ'	H9377	אבקה
קולורימטר קלט	מנוסטט	37012-0000	משתמש בהעברת צבע כדי להעריך את צפיפות התרבית
ל-אלנין	סיגמא-אולדריץ'	א7627	אבקה
ל-ארגינין	סיגמא-אולדריץ'	א5006	אבקה
ל-אספרגין מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	א8381	אבקה
ל-אספרטט	סיגמא-אולדריץ'	א9256	אבקה
ל-ציסטאין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	C1276	אבקה
ל-ציסטין	סיגמא-אולדריץ'	C8755	אבקה
ל-גלוטמט	סיגמא-אולדריץ'	G1251	אבקה
ל-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'	G3126	אבקה
L-היסטידין מונוהידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	H8125	אבקה
ל-איזולאוצין	סיגמא-אולדריץ'	I2752	אבקה
ל-לאוצין	סיגמא-אולדריץ'	L8000	אבקה
ל-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	L5501	אבקה
ל-מתיונין	סיגמא-אולדריץ'	M9625	אבקה
ל-פנילאלנין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 2126	אבקה
ל-פרולין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 0380	אבקה
ל-סרין	סיגמא-אולדריץ'	S4500	אבקה
ל-תראונין	סיגמא-אולדריץ'	T8625	אבקה
ל-טריפטופן	סיגמא-אולדריץ'	T0254	אבקה
ל-טירוזין	סיגמא-אולדריץ'	T3754	אבקה
ל-ולין	סיגמא-אולדריץ'	V0500	אבקה
מגנזיום גופרתי	סיגמא-אולדריץ'	M7506	אבקה
מתנול	VWR	BDH1135-4LP	נוזל דליק, יש לאחסן בארון דליקים
אשלגן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	60356	אבקה
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9791	אבקה
אשלגן גופרתי	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 0772	אבקה
עמילן תפוחי אדמה	סיגמא-אולדריץ'	S4251	אבקה
גלוטתיון מופחת	סיגמא-אולדריץ'	G4251	יש לטפל בזהירות. יכול להתחמצן בקלות.
S100A7	לא ישים	לא ישים	זה מסופק לנו על ידי משתף פעולה
נתרן ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S5761	אבקה
נתרן כלורי	VWR	470302	אבקה
נתרן ציטראט	פישר	S279	אבקה
נתרן הידרוקסיד	אקרוס אורגניקס	383040010	היגרוסקופיה גבוהה
תיאמין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	T4625	אבקה
תיאמין פירופוספט	סיגמא-אולדריץ'	C8754	נקרא גם קוקרבוקסילאז
TPEN	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4413	אבקה
טריס	VWR	497	אבקה
אורסיל	סיגמא-אולדריץ'	U0750	אבקה
אבץ גופרתי heptahydrate	סיגמא-אולדריץ'	204986	מגרה, לא לשאוף