איתור מובילי המתכות על פני השטח ב-Neisseria gonorrhoeae באמצעות כתם נקודות

תקציר

מקור: Maurakis, S., and Cornelissen, C. N. גידול מוגבל במתכת של Neisseria gonorrhoeae לאפיון גנים המגיבים למתכת ורכישת מתכת מליגנדים מארחים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את ההליך לזיהוי מובילי מתכות על פני השטח ב-Neisseria gonorrhoeae הגדלים בתנאים מוגבלים במתכת באמצעות בדיקת כתמי נקודות, הכוללת קשירת ליגנד, זיהוי נוגדנים והדמיה קולורימטרית.

פרוטוקול

1. איתור קשירת ליגנד על ידי מובילי מתכת ממברנה חיצונית

1. גב לדלל את התרביות בשלושה כרכים של CDM (מדיום מוגדר שטופל בצ'לקס).
2. לאחר מכן דגרו עם ניעור למשך 4 שעות.
3. זמן קצר לפני סימן 4 השעות, חותכים שלוש פיסות נייר פילטר ופיסת ניטרוצלולוזה לגודל המשוער הדרוש כדי להתאים למנגנון כתמי נקודות. יש להשרות מראש את הניטרוצלולוזה במים נטולי יונים, ולאחר מכן להרכיב את המנגנון עם נייר סינון מתחת לניטרוצלולוז.
4. לאחר 4 שעות, רשום את צפיפות התאים ותקן לצפיפות סופית מתאימה.
5. תרביות תאי פיפטה על הניטרוצלולוז ומאפשרות מספיק זמן לנייר הסינון לספוג את כל הנוזל.
6. לפרק את המכשיר, לאפשר לכתם להתייבש ולחסום את קרום הניטרוצלולוזה למשך שעה אחת באלבומין סרום בקר 5% או חלב דל שומן (w/v) במי מלח עם טריס.
7. הרכיבו מחדש את מנגנון כתם הנקודות, והחליפו את נייר הסינון בסרט פרפין כדי ליצור אטימה חסינת דליפות מתחת לניטרוצלולוז.
8. לדלל את ליגנד קשירת המתכת המעניין ל-0.2 מיקרומטר בתאי חוסם ובדיקה למשך שעה.
9. שואבים את הנוזל בוואקום, שוטפים את הכתם ואז פועלים לפי הליכים אימונולוגיים סטנדרטיים כדי לפתח את האות. שלבי הכביסה עשויים להיעשות בתוך המכשיר או מחוצה לו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלוחיות זרוע צד 125 מ"ל	בלקו	ברקוד 2578-S0030	יש להזמין בהתאמה אישית
2-מרקפטואתנול	VWR	M131	פתח במכסה אדים
נייר 3 מ"מ	בריאות מהונדסת גנטית	3030-6461	נקרא "נייר סינון" בטקסט
חוסם כיתה סופג	ביו-ראד	170-6404	חלב יבש ללא שומן
אלבומין סרום בקר	רוש	3116964001	אבקה
קלפרוטקטין	לא ישים	לא ישים	זה מסופק לנו על ידי משתף פעולה
שרף Chelex-100	ביו-ראד	142-2832	יש לשטוף במים נטולי יונים לפני השימוש
ספוגית סטרילית עם קצה כותנה	פוריטני	25-806	כותנה טובה יותר מפוליאסטר ליישום זה
מנגנון כתמי נקודות	שלייכר & שוול	10484138	נעל את המכסה בצורה הדוקה ככל האפשר לפני טעינת הדגימה
אתנול	קופטק	V1016	נוזל דליק, יש לאחסן בארון דליקים
קולורימטר קלט	מנוסטט	37012-0000	משתמש בהעברת צבע כדי להעריך את צפיפות התרבית
מתנול	VWR	BDH1135-4LP	נוזל דליק, יש לאחסן בארון דליקים
ניטרוצלולוזה	בריאות מהונדסת גנטית	10600002	יש לשמור במעטפת מגן עד לשימוש
S100A7	לא ישים	לא ישים	זה מסופק לנו על ידי משתף פעולה
נתרן כלורי	VWR	470302	אבקה
טריס	VWR	497	אבקה