מדידת שיעורי תרגום שגוי של Mycobacterium smegmatis באמצעות מערכת מדווח GFP/luciferase

תקציר

מקור: Chen, Y., et al., מדידה של שיעורי תרגום שגוי מיקובקטריאליים ספציפיים עם מערכות דיווח על רווח תפקוד. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים שיטה לכימות תרגום שגוי ב-Mycobacterium smegmatis באמצעות GFP הניתן להשראה ומערכת דיווח לוציפראז מוטנטית מופרשת. הוא מראה כיצד נמדדת זוהר הנובע מתרגום שגוי ומשווה אותה לפלואורסצנציה של GFP כדי להעריך את ההשפעה של מולקולת בדיקה על דיוק התרגום.

פרוטוקול

1. מדווח Nanoluc luciferase (Nluc)/חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).

הערה: לייצוג חזותי של שיטה זו, ראה איור 1.

1. חסנו את זן המדווח החיידקי ממלאי -80 מעלות צלזיוס עם 2 מ"ל של מדיום 7H9. יש לנער בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד ש-OD₆₀₀ מגיע לשלב הנייח (OD >3).
2. תת-תרבות ל-50 מ"ל של מדיום 7H9 וגדלה עד ש-OD₆₀₀ מגיע לשלב הנייח המאוחר (>4).
3. לפני שמכניסים את החיידקים לצלחת של 96 בארות, הוסיפו אנהידרוטטרציקלין (ATC) בריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל וערבבו היטב. אינדוקציה של תרבית בתפזורת מבטיחה שכל הבארות מכילות את אותה כמות של משרה ושהאינדוקציה של המדווח מסונכרנת. העבירו את החיידקים לצלחת שקופה עם תחתית עגולה של 96 בארות, עם נפח של 100 מיקרוליטר בכל באר.
4. כדי לסנן מולקולות קטנות המשפיעות על שיעורי התרגום השגוי, הוסף את התרכובת בריכוז המצוין לבארות נבחרות. למטרות פרוטוקול זה, השתמש ב-kasugamycin (במינונים המצוינים באיור 2) כהמחשה. הוסף מינונים שונים של קסוגמיצין לבארות נבחרות (כל קבוצת ניסוי צריכה להכיל לפחות שני שכפולים ביולוגיים).
5. לנער ולגרום לדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות.
   הערה: יש צורך לאטום את הצלחת בסרט. כמו כן, יש למלא את כל בארות הקצה בלפחות 200 מיקרוליטר של מים סטריליים כדי להגביל את האידוי מבארות הבדיקה.
6. קח 80 מיקרוליטר מכל באר, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, והעביר את הדגימות לצלחת שחורה של 96 בארות (מה שממקסם את מדידת אות הקרינה). מדוד את אות ה-GFP על ידי לומינומטר עם 20 אלפיות השנייה כזמן אינטגרציה.
7. לאחר מדידת אות ה-GFP, צנטריפוגה את הצלחת ב-3,220 x גרם למשך 10 דקות. העבירו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת עם תחתית לבנה של 96 בארות (מה שממקסם את מדידת אות הזוהר), הוסיפו 50 מיקרוליטר של מצע Nluc לכל באר, ערבבו אותם היטב ומדדו את הזוהר על ידי לומינומטר עם 1,000 אלפיות השנייה כזמן אינטגרציה.
8. קבע את יחס Nluc/GFP על ידי חלוקת ערכי הזוהר של Nluc המתוקנים בפלואורסצנציה GFP: מדד זה (ביחידות שרירותיות) הוא מדד יחסי של אספרטט לתרגום שגוי של אספרגין.

תוצאות

איור 1: מתווה למדידת שיעור התרגום השגוי של מדווח Nluc-GFP. תרבית טרייה של M. smegmatis, שהוסבה עם מדווחי Nluc ו-GFP, גדלה לנפח מספיק כדי שכל הלוחות ייבדקו (בהנחה של ~10 מ"ל/צלחת 96 בארות). מיד לפני הזרמת תרבית החיידקים לכל באר, גרמו לביט...

חומרים