איסוף נוזל שטיפת סימפונות מדגם עכבר נגוע בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג

תקציר

מקור: Venuprasad, K., et al. מתן תוך-קנה של המופילוס אינפלואנזה במודלים של עכברים לחקר דלקת בדרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את האיסוף והעיבוד של נוזל שטיפת הסימפונות מעכבר שעבר המתת חסד שנדבק בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. קולקציית נוזל שטיפת הסימפונות (BALF).
   1. הקריבו את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם 24 שעות לאחר ההדבקה.
   2. פתחו את חלל הבטן של העכבר בעזרת מספריים אנטומיים, חתכו את אבי העורקים הגחוני כדי לדמם וחשפו את החלק הגחוני של הריאה.
   3. חשוף את קנה הנשימה והחדיר אותו עם קטטר בגודל 20. יש להחדיר 0.8 מ"ל של חוצץ BALF (1x PBS (תמיסת מלח פוספט), 0.1% דקסטרוז, 10 U/ml הפרין) ולאסוף את השטיפה על ידי שאיבה עדינה. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
   4. ספרו את המספר הכולל של תאים ב-100 מיקרוליטר של תרחיף BALF באמצעות המוציטומטר בהגדלה של פי 10 עם צביעת טריפן כחול.
   5. הכן שקופיות לצביעה שונה של Giemsa. הכניסו 100 מיקרוליטר של BALF לבארות המתאימות של הציטוספין והצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות. יבש את השקופיות במשך 10 דקות וצבוע את התאים באמצעות כתם Giemsa שונה בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
   6. התאים הנותרים יכולים לשמש לניתוח עוקב, כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS), מיקרוסקופיה קונפוקלית, ביטוי גנים וכתם מערבי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דקסטרוז נטול מים	תמו מדעי	₪01300
הפארין	הוספירה בע"מ	RL-3010
מחט מזרק 20/26 גרם	ב.ד.	(REF305115/175)
מזרק 1 מ"ל	ב.ד.	סימוכין 309602
קטטר 20GA	ב.ד.	הפניה 381433
פינצטה #5 נירוסטה, אורך 11 ס"מ	קנטסיינטיפיק	INS600095
5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים	ב.ד.	סימוכין 352058
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	מעבדות אור	A-7001-R
1X PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט)	ג'יבקו	10010-023
מאגר ליזה RBC (10X)	ביולג'נד	420301