סנכרון תרביות ציאנובקטריאליות ודחיסת דנ"א המונעים על ידי מחזורי אור-חושך

תקציר

מקור: Murata, K. et al., הדמיה של דחיסת DNA בציאנובקטריה על ידי טומוגרפיה קריו-אלקטרונית במתח גבוה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הגידול הסינכרוני של ציאנובקטריה במחזורי אור-חושך כדי לחקור דחיסת DNA מווסתת צירקדית. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת DNA מרוכז בנקודות זמן מוגדרות, ומאשרת את יישור מחזור התא על פני האוכלוסייה.

פרוטוקול

1. תרבית סינכרונית של ציאנובקטריה

1. תרבית Synechococcus elongatus PCC 7942 על צלחת בינונית כחולה-ירוקה 11 (BG 11) מעוקרת (בצלחת פטרי פלסטיק סטרילית בגודל 9 ס"מ) המכילה 1.5% אגר (w/v) ו-0.3% (w/v) נתרן תיוסולפט.
2. הנח את הלוחות בתא גידול בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור של 50 μE/m²/s והכפיף אותם למחזורי אור של 12 שעות/12 שעות חושך.
3. העבירו את התאים לצלחות אגר BG11 טריות פעם בשבוע.
   הערה: התרביות על האגר יופיעו כרצועות ירוקות של תאים המתרבים באופן פעיל לאחר שבוע בתנאי תרבית אלה.
4. קח גושים ירוקים של תאים עם לולאת תיל מעוקרת להבה ופס את התאים על צלחת אגר BG11 טרייה. עשו זאת על ספסל נקי.

2. ניטור במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. השתמש בתאים שגודלו על צלחת האגר במשך 6 ימים כדי לצפות בדחיסת DNA. אסוף תאים מהצלחת בסוף תקופת האור על ידי שפיכת 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 0.2 M על התאים. חזור על יציקת התמיסה על התאים כך שרוב התאים ייאספו. העבירו את תמיסת התא המרחף למיקרו-צינור לצביעת DNA.
2. הוסף תמיסת צבע צביעת DNA (למשל, Hoechst 33342) ל-500 מיקרוליטר של תמיסת התא המרחף במיקרו-צינור לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן, שמור את הצינור בחושך למשך 10 דקות.
3. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 x גרם כדי לשקוע את התאים. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז של 0.2 M כדי לקבל תרחיף תאים צפוף.
4. העבירו 1 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה תאים מוכתמים לזכוכית שקופית, הניחו פתק כיסוי והתבוננו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן אולטרה סגול (UV) באמצעות עדשת אובייקטיבית עם הגדלה של פי 100 ושמן טבילה.
5. אשר כי דחיסת ה- DNA נצפית בשלב זה ברוב התאים.

חומרים