סנכרון תרביות ציאנובקטריאליות ודחיסת דנ"א המונעים על ידי מחזורי אור-חושך

תקציר

מקור: Murata, K. et al., הדמיה של דחיסת DNA בציאנובקטריה על ידי טומוגרפיה קריו-אלקטרונית במתח גבוה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הגידול הסינכרוני של ציאנובקטריה במחזורי אור-חושך כדי לחקור דחיסת DNA מווסתת צירקדית. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת DNA מרוכז בנקודות זמן מוגדרות, ומאשרת את יישור מחזור התא על פני האוכלוסייה.

פרוטוקול

1. תרבית סינכרונית של ציאנובקטריה

1. תרבית Synechococcus elongatus PCC 7942 על צלחת בינונית כחולה-ירוקה 11 (BG 11) מעוקרת (בצלחת פטרי פלסטיק סטרילית בגודל 9 ס"מ) המכילה 1.5% אגר (w/v) ו-0.3% (w/v) נתרן תיוסולפט.
2. הנח את הלוחות בתא גידול בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור של 50 μE/m²/s והכפיף אותם למחזורי אור של 12 שעות/12 שעות חושך.
3. העבירו את התאים לצלחות אגר BG11 טריות פעם בשבוע.
   הערה: התרביות על האגר יופיעו כרצועות ירוקות של תאים המתרבים באופן פעיל לאחר שבוע בתנאי תרבית אלה.
4. קח גושים ירוקים של תאים עם לולאת תיל מעוקרת להבה ופס את התאים על צלחת אגר BG11 טרייה. עשו זאת על ספסל נקי.

2. ניטור במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. השתמש בתאים שגודלו על צלחת האגר במשך 6 ימים כדי לצפות בדחיסת DNA. אסוף תאים מהצלחת בסוף תקופת האור על ידי שפיכת 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 0.2 M על התאים. חזור על יציקת התמיסה על התאים כך שרוב התאים ייאספו. העבירו את תמיסת התא המרחף למיקרו-צינור לצביעת DNA.
2. הוסף תמיסת צבע צביעת DNA (למשל, Hoechst 33342) ל-500 מיקרוליטר של תמיסת התא המרחף במיקרו-צינור לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן, שמור את הצינור בחושך למשך 10 דקות.
3. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 x גרם כדי לשקוע את התאים. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז של 0.2 M כדי לקבל תרחיף תאים צפוף.
4. העבירו 1 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה תאים מוכתמים לזכוכית שקופית, הניחו פתק כיסוי והתבוננו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן אולטרה סגול (UV) באמצעות עדשת אובייקטיבית עם הגדלה של פי 100 ושמן טבילה.
5. אשר כי דחיסת ה- DNA נצפית בשלב זה ברוב התאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פתרון Hoechst 33342	Dojindo	346-07951	1 מ"ג/מ"ל במים
אבקת אגר (לתרבית צמחים)	וואקו	016-11875
חומצה בורית	וואקו	027-02192
מנגן כלוריד טטרהידרט	וואקו	139-00722
אבץ גופרתי הפטהידראט	וואקו	264-00405
נתרן מוליבדט	וואקו	196-02472
נחושת גופרתית פנטהידראט	וואקו	039-04412
קובלט חנקתי הקסהידרט	וואקו	031-03752
נתרן חנקתי	וואקו	191-02542
מגנזיום גופרתי הפטהידרט	וואקו	131-00405
סידן כלוריד מיובש	וואקו	031-00435
חומצת לימון	וואקו	036-05522
EDTA-2Na	Dojindo	343-01861
נתרן פחמתי	וואקו	197-01581
אשלגן פוספט דו-בסיסי	וואקו	164-04295
TES (מאגר של גוד)	Dojindo	344-02653
אמוניום ציטראט ברזל	וואקו	092-00802
נתרן תיוסולפט פנטהידראט	וואקו	197-03585
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	ליקוי 50i