סינתזה של אנטיגנים של חלבון ממברנה מיוצב ננו-דיסק באמצעות מערכת נטולת תאים

תקציר

מקור: Gilmore, S. F., et al. ייצור בקנה מידה נטול תאים ותוספת אדג'ובנטית לחלבון ממברנה חיצונית ראשי רקומביננטי מ-Chlamydia muridarum לפיתוח חיסון. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הסינתזה נטולת התאים של אנטיגנים של חלבון ממברנה מיוצב ננו-דיסק באמצעות מערכת כפולה. המכשיר שומר על תנאים אופטימליים לסינתזה יעילה של חלבונים, קיפול נכון ואינטגרציה יציבה בננו-דיסקים.

פרוטוקול

ייצור נטול תאים של חלקיקי ננו-ליפופרוטאין עיקריים של חלבון הממברנה החיצונית (MOMP-tNLPs) עבור פורמולציות חיסון תת-יחידות

1. הכן MOMP-tNLPs בשיטות נטולות תאים.
   1. שעתיים לפני הגדרת התגובה נטולת התאים, פתח את ערכת ביטוי החלבון הפרוקריוטית ללא תאים והפשיר את אחד ממאגרי הבנייה מחדש. לאחר ההפשרה, יש להוסיף טבליה אחת של קוקטייל מעכב פרוטאז ללא חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ולתת לו להתמוסס במלואו.

2. עקוב אחר פרוטוקול זה באמצעות ערכה המיועדת להריץ תגובות של 5 x 1 מ"ל.

   הערה: ייצור הגדלה טיפוסי הוא 3 x 1 מ"ל.

   1. עבור כל תגובה של 1 מ"ל, הוסף 525 מיקרוליטר של מאגר בנייה מחדש לבקבוק הליזאט של E. coli וגלגל בעדינות להמסה. הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר בנייה מחדש לבקבוק המכיל תוספי תגובה (למשל, אדנוזין טריפוספט, גואנוזין טריפוספט) וגלגל בעדינות להמסה.
   2. הוסף 8.1 מ"ל של מאגר בנייה מחדש לבקבוק הזנת התגובה, סיכום עם פקק גומי (הקפד לא לגעת בחלק הפנימי של פקק הגומי), והפוך / גלגל בעדינות כדי להתמוסס.
   3. יש להוסיף 3 מ"ל של חוצץ בנייה מחדש לבקבוק תערובת חומצות האמינו, לעטוף עם פקק גומי ולהפוך / לגלגל בעדינות להמסה.
      הערה: הקפד לא לגעת בחלק הפנימי של פקק הגומי מכיוון שהדבר עלול להוביל לזיהום.
   4. הוסף 1.8 מ"ל של מאגר בנייה מחדש לבקבוק המתיונין, גלגל בעדינות להמסה ולאחר מכן אחסן על קרח עד לשימוש.
       
3. הכן את תמיסת התגובה.
   1. לבקבוק E. coli ליזאט, הוסף 225 מיקרוליטר של תערובת תגובה משוחזרת, 270 מיקרוליטר של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין, ו-30 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר. בנוסף, הוסף 400 מיקרוליטר של תערובת 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)/telodendrimer, 15 מיקרוגרם של פלסמיד MOMP ו-0.6 מיקרוגרם של פלסמיד Δ49ApolipoproteinA1. מגלגלים/מנערים בעדינות כדי לערבב.
      הערה: ודא ששני הפלסמידים בנויים מאותו עמוד שדרה של פלסמיד. אין מערבולת.
   2. קח 20 מיקרוליטר מהתמיסה הכוללת והניח אותה בצד בשפופרת של 1.5 מ"ל לתגובת הבקרה המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (ראה להלן).
       
4. הכן את תמיסת ההזנה. לבקבוק תערובת ההזנה, הוסף 2.65 מ"ל של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין ו-300 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר. יש לגלגל/לנער בעדינות עד להתמוססות.
   הערה: בשלב זה, ניתן להחזיר את מאגר הבנייה מחדש והמתיונין שאינם בשימוש למקפיא לאחסון.
    
5. העבירו 1 מ"ל מתמיסת התגובה לתא התגובה הפנימי המסופק בערכת התגובה נטולת התאים ואטמו כשהוא מלא. העבירו 10 מ"ל מתמיסת ההזנה לתא החיצוני של כלי התגובה ואטמו.
   הערה: אל תמלא יתר על המידה את התאים! נוכחותן של בועות אוויר בחלק העליון של תא התגובה הפנימי ותא ההזנה הפנימי תשפיע לרעה על התגובה. כל תמיסת תגובה שנותרה יכולה להיות מונחת בצינור של 1.5 מ"ל ולאפשר לה להתערבב לצד הכלי הראשי.
    
6. הוסף 0.5 מיקרוליטר של פלסמיד בקרת GFP (0.5 מ"ג/מ"ל) לתערובת התגובה של 20 מיקרוליטר שהוזכרה בעבר.
   הערה: ערכות רבות מסופקות עם פלסמיד בקרה למטרות בקרת איכות. רוב ה-GFP המבטא פלסמיד עם מקדם T7 ואתר קשירת ריבוזום E.coli (RBS) יכול לשמש גם כפלסמיד הבקרה.
    
7. הניחו את התגובה בשייקר ב-300 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס למשך עד 18 שעות. כדי לוודא שהתגובה הייתה מוצלחת, השתמשו במקור אור אולטרה-סגול כדי לבדוק אם יש פלואורסצנטיות עקב הסינתזה של ה-GFP הבקרה (איור 1) לאחר 15 דקות בלבד של הדגירה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של תנאים אלה, במיוחד טמפרטורה, לביטוי של חלבוני ממברנה אחרים.

תוצאות

איור 1: ביטוי וטיהור של MOMP-tNLP. (A) תמונה של שפופרות המכילות כמויות קטנות של תגובה נטולת-תאים המבטאות בהצלחה בקרות GFP המאירות, תחת מקור אור UV (מימין) בהשוואה לליזטים ללא פלסמיד GFP (משמאל). (ב) ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,2-דימיריסטויל-SN-גליצרו-3-פוספוכולין (DMPC) כאבקה	ליפידים קוטביים של Avanti	850345
צינורות צנטריפוגה ללא אנדוטוקסין 1.5 מ"ל	אפנדורף	2600028
שייקר חממה C24	ניו ברונסוויק סיינטיפיק
מערכת ביטוי ללא תאים: ערכת RTS 500 ProteoMaster E. coli HY	ביוטקארנב	BR1400201
cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA	רוש אבחון מולקולרי	4693132001
שייקר אורביטלי
PEG5K-CA8 טלודנדרמר (מוצר סינתזה מותאם אישית)
וקטור pIVEX2.4d	רוש אבחון מולקולרי
ערכת מקסי פלסמיד	קיגן	12162
מקור אור UV