כתם מערבי להערכת השלמות המבנית של אנטיגן חיסון חיידקי

תקציר

מקור: Gilmore, S. F. et al. ייצור בקנה מידה נטול תאים ותוספת אדג'ובנטית לחלבון ממברנה חיצונית ראשי רקומביננטי מ-Chlamydia muridarum לפיתוח חיסון. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את השימוש בכתמים מערביים כדי להעריך את השלמות המבנית של חלבון הממברנה החיצונית העיקרית (MOMP) בתוך קומפלקסים של חיסונים מבוססי ננו-חלקיקים. הוא מתאר את השלבים העיקריים המעורבים בהעברת חלבון, תיוג נוגדנים והדמיה פלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. כתם מערבי

1. עבור Western Blotting, פתרו את חלבון הממברנה החיצונית העיקרית (MOMP) - חלקיקי ננו-ליפופרוטאין טלודנדרים (tNLPs) על ידי SDS-PAGE והעבירו את הג'לים באמצעות מערכת מסחרית של ניקוי יבש עם הגדרות סטנדרטיות בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   1. הסר את הכתמים מהערימה לאחר השלמת ההעברה, ודגר כל כתם למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס במאגר חוסם מתאים המכיל 0.2% Tween 20 ונוגדנים חד שבטיים (MAb) 0.5 מ"ג/מ"ל 40 או 0.2 מ"ג/מ"ל MAbHIS נגד ה-His-tag המכוון כנגד ה-His-tag מחלבון Δ49ApoA1.
      הערה: דילול הנוגדנים המשמש לכתמים הוא 1:1,000 עבור MAb40 ו-1:500-1,000 עבור נוגדן MAbHIS.
   2. שטפו כל כתם 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBS-T (1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 0.2% טווין 20, pH 7.4).
   3. דגרו את הכתמים למשך שעה אחת במאגר חוסם המכיל נוגדנים משניים מצומדים לפלואורופור (למשל, צבע אינפרא אדום (IRDye)) בדילול של 1:10,000.
   4. שטפו מחדש את הכתמים 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBS-T. השתמש בהדמיית פלואורסצנטיות כדי לצלם את הכתמים לאחר הכביסה הסופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
iBlot+2:22 מערכת ניקוי יבש	טכנולוגיות חיים
ערימות העברה iBlot 2, PVDF	טכנולוגיות חיים	IB24001
תוכנת Image Studio V2.0	Li-COR Biiosciences
קרום PVDF Immun-Blot	ביו-ראד	1620177
מצלמת LI-COR Odyssey Fc	Li-COR Biiosciences
מאגר חסימת אודיסיאה ב-TBS המכיל 0.2% טווין 20	Li-COR ביוסיינסס	927-50000
שייקר אורביטלי
PBS-T (1x PBS, 0.2% טווין 20, pH 7.4)
נוגדן ראשוני: MAb40 (נוגדן חד שבטי לתחום המשתנה 1 (VD1) של C. muridarum MOMP
נוגדן ראשוני: MAbHIS, נוגדן Penta-His	קיגן	34660
נוגדן משני: IRDye 800CW עז (פוליקלונלית) IgG נגד עכבר (כבד וקל)	Li-COR ביוסיינסס	926-32210