הכנה וטרנספורמציה של חיידקים באמצעות אלקטרופורציה במתח גבוה

Abstract

מקור: Stefan, A., et al., היתרונות הרב-צדדיים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את ההליך להפיכת Escherichia coli עם פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, כולל הכנת תאים, אלקטרופורציה, התאוששות ובחירת טרנספורמציה.

Protocol

1. בידוד של טרנספורמנטים משותפים של E. coli

1. הכן תאים מוכשרים אלקטרו-מוכשרים של זן E. coli המתאים לשינוי. מעבירים ל-1 מ"ל של מדיום Luria-Bertani (LB) (טריפטון, תמצית שמרים, NaCl ב-10, 5 ו-10 גרם/ליטר, בהתאמה) מושבה אחת של הזן הנבחר, ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי רעידות של 180 סל"ד. יש לדלל את קדם התרבית 1:500 ב-25 מ"ל של מדיום LB טרי ולדגור את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס.
2. בשלב היומן (0.6 OD או צפיפות אופטית), צנטריפוגה את תרחיף התא ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות, והשהה מחדש את הגלולה ב-10%, מי גליצרול סטריליים קרים כקרח במחצית מנפח התרבית המקורית. חזור על שלב זה 4 פעמים, תוך חציית נפח ההשעיה. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה בגליצרול/מים וחלקו את תרחיף התא ל-50 מיקרוליטר אליקוטים. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
3. ממיסים את הפלסמיד הרצוי במים סטריליים בתוספת 0.5 מ"מ EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית). להפשיר כמות גדולה של תאים בעלי יכולת חשמלית על קרח ולערבב עם כמות מתאימה (2.5-5 ננוגרם) של וקטור. מחלקים את התערובת לקובטה בקוטר 0.1 ס"מ המתאימה לאלקטרופורציה ומורחים 1.8 קילו וולט.
4. העבירו מיד את התאים החשמליים לתוך 1 מ"ל של מדיום SOC (מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט) (מדיום LB בתוספת 0.2% w/v גלוקוז, 10 מ"מ MgCl₂, 2.5 מ"מ KCl), דגירה למשך שעה אחת תחת ניעור, ולבסוף העבירו 100 מיקרוליטר אליקוטים לצלחות פטרי המכילות אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה O/N ב-37 מעלות צלזיוס.
5. טהר את הטרנספורמטורים על ידי פיזור מושבות בודדות על צלחות פטרי.

Materials