הערכת שכיחות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז

Abstract

מקור: Stefan, A., et al. היתרונות הרב-גוניים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

סרטון זה מדגים את הערכת תדירות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז. תרביות חיידקים המבטאות פולימראז DNA חסר הגהה נאספות לאורך דורות עוקבים. שגיאות שכפול הנגרמות על ידי הגהה מופחתת עלולות להפעיל גן בטא-גלוקוזידאז מדוכא. לאחר צנטריפוגה וחדירה, מוסיפים סובסטרט ונמדדת פעילות אנזים כדי לכמת את תדירות המוטציות על פני דגימות.

Protocol

1. בידוד של Escherichia coli או E. coli Co-transformants

1. הכן תאים מוכשרים אלקטרו-מוכשרים של זן E. coli המתאים לשינוי. יש להעביר ל-1 מ"ל של מדיום Luria-Bertani (LB) (טריפטון, תמצית שמרים, נתרן כלורי או NaCl ב-10, 5 ו-10 גרם/ליטר, בהתאמה) מושבה אחת של הזן הנבחר, ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי רעידות של 180 סל"ד. יש לדלל את קדם התרבית 1:500 ב-25 מ"ל של מדיום LB טרי ולדגור את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס.
2. בשלב היומן (0.6 OD), צנטריפוגה את תרחיף התא ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות, והשהה מחדש את הגלולה ב-10%, מי גליצרול סטריליים קרים כקרח במחצית מנפח התרבית המקורי. חזור על שלב זה....

Materials