הערכת שכיחות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז

תקציר

מקור: Stefan, A., et al. היתרונות הרב-גוניים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

סרטון זה מדגים את הערכת תדירות המוטציות בחיידקים באמצעות בדיקת בטא-גלוקוזידאז. תרביות חיידקים המבטאות פולימראז DNA חסר הגהה נאספות לאורך דורות עוקבים. שגיאות שכפול הנגרמות על ידי הגהה מופחתת עלולות להפעיל גן בטא-גלוקוזידאז מדוכא. לאחר צנטריפוגה וחדירה, מוסיפים סובסטרט ונמדדת פעילות אנזים כדי לכמת את תדירות המוטציות על פני דגימות.

פרוטוקול

1. בידוד של Escherichia coli או E. coli Co-transformants

1. הכן תאים מוכשרים אלקטרו-מוכשרים של זן E. coli המתאים לשינוי. יש להעביר ל-1 מ"ל של מדיום Luria-Bertani (LB) (טריפטון, תמצית שמרים, נתרן כלורי או NaCl ב-10, 5 ו-10 גרם/ליטר, בהתאמה) מושבה אחת של הזן הנבחר, ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי רעידות של 180 סל"ד. יש לדלל את קדם התרבית 1:500 ב-25 מ"ל של מדיום LB טרי ולדגור את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס.
2. בשלב היומן (0.6 OD), צנטריפוגה את תרחיף התא ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות, והשהה מחדש את הגלולה ב-10%, מי גליצרול סטריליים קרים כקרח במחצית מנפח התרבית המקורי. חזור על שלב זה 4 פעמים, והפחית בחצי את נפח ההשעיה בכל פעם. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה בגליצרול/מים וחלקו את תרחיף התא ל-50 מיקרוליטר אליקוטים. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
3. ממיסים את הפלסמיד הרצוי במים סטריליים בתוספת 0.5 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA). להפשיר על הקרח כמות גדולה של תאים בעלי יכולת אלקטרו-מוכשרת ולערבב עם כמות מתאימה (2.5-5 ננוגרם) של וקטור. מחלקים את התערובת לקובטה בקוטר 0.1 ס"מ המתאימה לאלקטרופורציה, ומורחים 1.8 קילו וולט.
4. העבירו מיד את התאים האלקטרופורטיים ל-1 מ"ל של מרק סופר אופטימלי עם מדיום דיכוי קטבוליט (SOC) (מדיום LB בתוספת 0.2% w/v גלוקוז, 10 מ"מ מגנזיום כלוריד או MgCl₂, 2.5 מ"מ אשלגן כלורי או KCl), דגירה למשך שעה אחת תחת טלטול, ולבסוף העבירו 100 מיקרוליטר aliquots לצלחות פטרי המכילות אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה למשך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. טהר את הטרנספורמטורים על ידי פיזור מושבות בודדות על צלחות פטרי.
6. הכן תאים מוכשרים אלקטרו-מוכשרים של הטרנספורמנטים העיקריים וחזור על שלבים 1.1 עד 1.5 כדי להפוך עם פלסמידים נוספים.
7. הכן מלאי גליצרול של הטרנספורמציה. להעביר מושבה בודדת ב-LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה, לדגור ב-37 מעלות צלזיוס תחת טלטול, ובשלב הלוגי (0.6 OD), לצנטריפוגה את תרחיף התא ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות. השעו מחדש את הגלולה במדיום אנטיביוטיקה LB המכיל 15% v/v גליצרול. יש לחלק בכמויות ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. ניתוח מוטציות של אוכלוסיות המבטאות במשותף את תת-היחידה ε מסוג הבר של E. coli DNA Polymerase III והוריאנט המוטגני εD12A

1. העבירו מושבה אחת של E. coli TOP10 המכילה את הווקטור pBAD-ε ו-pGOOD1-εD12A ל-1 מ"ל של מדיום אנטיביוטיקה LB. דגירה O/N ב-37 מעלות צלזיוס.
2. יש לדלל את קדם התרבית 1:250 ב-3 צלוחיות המכילות מדיום טרי (10 מ"ל), להוסיף את המשרה המתאימה (ארבינוז, איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), או ארבינוז ו-IPTG, 1 מ"מ כל אחת), ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות. הכן בתרביות מקבילות שאינן מושרות.
3. יש לאסוף כמות של 1 מ"ל, ולאחר מכן לדלל 1:500 בצלוחיות חדשות המכילות מדיום טרי (10 מ"ל) בתוספת או ללא משרה מתאימה. דגירה O/N ב-37 מעלות צלזיוס.
4. חזור על שלבים 2.2 ו-2.3 ואסוף כמויות של 1 מ"ל.
5. קבע את מספר הדורות שהתרחשו בכל תרבות. העברה על לוחות LB, 100 מיקרוליטר של דילולים סדרתיים מתאימים של חיסון ותרבית. דגירה O/N ב-37 מעלות צלזיוס. ספרו את המושבות על לוחות LB, וחשבו את הלוג של מספר התאים הקיימים בחיסון (log_I) ובתרבית בסוף הגידול (log_C). כדי לקבוע את מספר הדורות, השתמש בנוסחה: (log_C– log_I)/0.301.
6. צנטריפוגה ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות ולהשעות את התאים ב-1 מ"ל של 50 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl), pH 7.6, 50 מ"מ NaCl. כדי לחדור לתאים, הוסף 2-3 טיפות כלורופורם ומערבולת למשך 20 שניות.
7. קבע את פעילות β-גלוקוזידאז של כל אליקוט במיקרו-פלטה של 96 בארות, תוך שימוש ב-p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) כמצע. הוסף לכל באר 100 מיקרוליטר תאים חדירים ו -100 מיקרוליטר מצע (תמיסת מלאי של 16 מ"ג/מ"ל במים או H₂O). הקפידו להימנע מבועות אוויר בבארות. קרא את הספיגה ב-420 ננומטר, באמצעות קורא מיקרו-פלטות והמסנן המתאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	סיגמא-אולדריץ'	א 1296
אמפיצילין	סיגמא-אולדריץ'	א9518
כלורופורם	סיגמא-אולדריץ'	288306
EDTA	סיגמא-אולדריץ'	עורכים
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516
IPTG	סיגמא-אולדריץ'	I5502
KCl	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541
ל-ארבינוז	סיגמא-אולדריץ'	א3256
MgCl₂	סיגמא-אולדריץ'	M2670
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	31434
PMSF	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 7626
PNP-גלוק	סיגמא-אולדריץ'	N7006
טטרציקלין	סיגמא-אולדריץ'	87128
בסיס טריזמה	סיגמא-אולדריץ'	T1503
טריפטון	סיגמא-אולדריץ'	95039
תמצית שמרים	פלוקה	70161
קובטות 0.1 ס"מ	ביוראד	1652089	לאלקטרופורציה
צנטריפוגה 5415R	אפנדורף
צנטריפוגה אלגרה 21R	בקמן
מכשיר כרומטוגרפיה GradiFrac	פארמסיה ביוטק
אלקטרופורציה של Gene Pulser II	ביוראד
קורא מיקרופלייט 550	ביורד
MiniProtean 3 תאים	ביוראד
ספק כוח	ביוראד