מיצוי וטיהור פלסטוגלובולות מחיידקים פוטוסינתטיים

תקציר

מקור: Shivaiah, K., et al. בידוד טיפות ליפידים של פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון מדגים את הבידוד של פלסטוגלובולות מציאנובקטריה. זה מתחיל בתרבית של ציאנובקטריה וממשיך דרך שיבוש תאים באמצעות כוח מכני. שחרור פיגמנטים פוטוסינתטיים מעיד על ליזה מוצלחת. לאחר מכן משתמשים בשיפוע צעד סוכרוז כדי להפריד רכיבים תאיים לפי צפיפות, מה שמאפשר לפלסטגלובולות בצפיפות נמוכה ליצור פס מובהק בחלקו העליון. חלק זה נאסף ונשמר להמשך ניתוח.

פרוטוקול

1. בידוד פלסטוגלובול גולמי

1. מיצוי פלסטוגלובול גולמי מציאנובקטריה
   1. גדל תרבית של 50 מ"ל של Synechocystis sp. PCC 6803 לשלב הנייח (כ-7-10 ימים) והתאם את צפיפות התאים לצפיפות אופטית ב-750 ננומטר (OD₇₅₀) של 2.0 באמצעות ספקטרופוטומטר. בתנאי תרבית, השתמש במדיה BG-11 וגידול באינקובטור בעוצמת אור של 150 מיקרומול פוטונים/מ"^{ר לשנייה}, 2% CO₂, 32 מעלות צלזיוס, ועם טלטול מתמשך ב-150 סיבובים לדקה (סל"ד).
   2. כדי להסיר את הפוליסכרידים, שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה של תרבית 50 מ"ל ב-6,000 × גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הסרת הסופרנטנט. המשך בשטיפת התאים פעמיים ב-50 מ"ל של מאגר A (טבלה 1). הסר אליקווט של התא הומוגנאט והניח אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן כדגימת תא כוללת מייצגת
   3. השעו מחדש את הגלולה השטופה ב-25 מ"ל של מאגר A ושברו את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב-1,100 פאונד לאינץ' רבוע (psi), וחזרו על התהליך 3× (הניחו את הדגימה על קרח בין כל מחזור כדי למנוע דנטורציה של חלבון) עד שהצבע הליזי משתנה מירוק לאדום-כחול-ירוק באור לבן. השתמש בתא מקורר מראש ובצע שלב זה בחדר הקירור.
   4. מחלקים את ההומוגנאט המתקבל בין שמונה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 3 מ"ל מלאים עד למקסימום של 2.5 מ"ל בכל צינור ולאחר מכן מכסים בזהירות 400 מיקרוליטר של מדיום R, ויוצרים שיפוע מדרגה.
   5. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת מדיום R נוסף, לפי הצורך, וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-150,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. התילקואיד ואברונים כבדים אחרים (כולל כל גופי הפוליהידרוקסיאלקנואטים) יתגלו, בעוד שפלסטוגלובולים ייראו בקלות כפד צהוב ושמנוני על החלק העליון של שיפוע הסוכרוז או בסמוך לו (איור 1C).
   6. קצרו את הכרית הצפה המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים בעזרת מזרק ומחט 22G והפקידו בצינור של 2 מ"ל. מגרדים פלסטוגלובולות מהצד של דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה עם קצה המחט במידת הצורך.
   7. המשך לשלב 2.2. לחלופין, אחסן פלסטוגלובולות גולמיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וטהר מאוחר יותר.

טבלה 1: מתכוני חיץ לבידוד פלסטוגלובול מרקמת עלי צמח או ציאנובקטריה.

קומפוזיציות חיץ א
מאגר שחיקה	50 מ"מ hepes-koh (pH 8.0)
	5 מ"מ מגנזיום כלוריד (MgCl2)
	סורביטול 100 מ"מ
	5 מ"מ חומצה אסקורבית b
	5 מ"מ ציסטאין b מופחת
	0.05 % (w/v) סרום בקר אלבומין (BSA) b
בינוני ר	50 מ"מ hepes-koh (pH 8.0)
	5 מ"מ MgCl2
בינוני R 0.2	50 מ"מ hepes-koh (pH 8.0)
	5 מ"מ MgCl2
	0.2 מ סוכרוז
בינוני R 0.7	50 מ"מ hepes-koh (pH 8.0)
	5 מ"מ MgCl2
	0.7 מ סוכרוז
מאגר א	25 מ"מ hepes-koh (pH 7.8)
	250 מ"מ סוכרוז
a. ריכוזים סופיים של כל רכיב חיץ מסופקים.
b. יש להוסיף טרי ביום הבידוד. אמנם ניתן להכין בופר יום לפני הבידוד, אך יש להוסיף מרכיבים מסוימים טריים ביום הבידוד, כמו גם מעכבי פוספטאז ופרוטאז.

2. קציר פלסטוגלובולים טהורים

1. עיבוד ציאנובקטריה
   1. לייצר שיפוע סוכרוז בארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגות של 2.5 מ"ל, בשכבות ראשונות עם 500 מיקרוליטר של הפלסטגלובולות הגולמיות משלב 1.3 מעורבב עם 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.7, ולאחר מכן כיסוי עם 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.2.
   2. צנטריפוגה את שיפוע הסוכרוז ב-150,000 × גרם למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אסוף את הפלסטגלובולות הטהורות (איור 1C) עם מזרק ומחט 22 גרם מהשלב העליון של שיפוע הסוכרוז והעביר לצינור של 1.5 מ"ל.
   3. הקפיא את הפלסטגלובולות הטהורות והקפיא בזק בחנקן נוזלי. יש לאחסן ישירות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או ליופיליז לאבקה יבשה.

תוצאות

איור 1: בידוד ואימונובלוטינג של פלסטוגלובולים ותילקואידים. (A) דגימת פלסטוגלובול מטוהרת מייצגת מ-Z. mays לפני מיצוי משיפוע הסוכרוז. (B) דגימת פלסטוגלובול גולמית מייצגת מ-E. nindensis מיובש לפני...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אסקורבט	ב.ד.ה	BDH9242
סרום בקר אלבומין	Proliant ביולוגי	68700
תא לחץ צרפתי (דגם FA-079)	SLM/אמינקו	לא ישים
הפס	סיגמא אולדריץ'	H3375
מגנזיום כלוריד	סיגמא אולדריץ'	M8266
אינקובטור טלטול מולטיטרון	מידע HT	לא ישים
אשלגן הידרוקסיד	פישר כימיקלים	M16050
ציסטאין מופחת	מ.פ. ביוכימיקלים	101444
סורביטול	סיגמא אולדריץ'	S3889
סוכרוז	סיגמא אולדריץ'	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	לא ישים	לא ישים
אופטימה MAX-TL אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	א95761