הערכת קולוניזציה של חיידקי מעיים ב - C. elegans נטול חיידקים

תקציר

מקור: טיילור, מ.נ., et.al. שימוש בנתוני תולעת בודדת כדי לכמת הטרוגניות באינטראקציות חיידקיות-חיידקיות Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את החשיפה של תולעי Caenorhabditis elegans נטולות חיידקים ותואמות גיל לזן חיידקים לצורך קולוניזציה של המעי. זה מסביר את ההסרה הסלקטיבית של חיידקים חיצוניים שאינם נדבקים, ומשאירים רק חיידקים ברי קיימא דבוקים לאפיתל המעי לצורך כימות.

פרוטוקול

1. האכלת תולעים על חיידקים חיים בתרבית נוזלית

הערה: פרוטוקול זה משמש ליישוב תולעים עם חיידקים שגודלו במעבדה בתנאים מעורבים היטב בתרבית נוזלית. ניתן ליישב תולעים עם מבודדים בודדים מתרבית טהורה (למשל, פתוגנים כגון Enterococcus faecium) או תערובות של מבודדים (למשל, קהילות מיקרוביום מינימליות).

1. התחל עם תולעים בוגרות מסונכרנות שטופות סוכרוז בצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטפו את התולעים פעם ב-12 מ"ל של מאגר S והשליכו את הסופרנטנט.
2. השעו מחדש את התולעים השטופות בנפח מדיום S הדרוש לניסוי. קחו בחשבון את נפח תנאי הניסוי, את מספר התנאים שבהם התולעים יתפצלו, ואת הריכוזים הסופיים של תולעים וחיידקים.
   הערה: האכלה בתולעים משתנה בהתאם לזמינות החיידקים ותולעים יכולות להילחץ על ידי צפיפות. להתיישבות בתרבית נוזלית, מומלץ <1000 תולעים/מ"ל ו->10⁷ CFU/mL; 10¹¹ CFU/mL נחשב לצפיפות הזנה "אד ליביטום" על E. coli.
3. סובב תרביות חיידקים. יוצקים את הסופרנטנט; ניתן להשתמש בשאיפה או בפיפטינג כדי להסיר את הסופרנטנט עבור חיידקים היוצרים כדורים רופפים.
   הערה: עבור תרבויות >5 מ"ל, העבירו לצינורות של 15 מ"ל וסובבו בטמפרטורה של ~2800 x גרם בצנטריפוגה גדולה על השולחן למשך 8-10 דקות. ניתן להעביר תרביות <5 מ"ל לצינורות של 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה ב-9000 x גרם למשך 1-2 דקות בצנטריפוגה קטנה על השולחן. חיידקים בעלי תנועה גבוהה (למשל, מינים רבים של Pseudomonas) עשויים להזדקק לקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות כדי להקל על היווצרות כדור יציב, וייתכן שעדיף לצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס.
4. השעו מחדש תרביות חיידקים בנפח אחד של מאגר S וצנטריפוגה שוב לגלולה. הסר והשליך את הסופרנטנט כמו קודם.
5. השעו מחדש תרביות חיידקים במדיום S בצפיפות הרצויה לניסוי, בתוספת כל אנטיביוטיקה לבחירה. האנטיביוטיקה שבה יש להשתמש, אם בכלל, תהיה תלויה בפרופיל העמידות של החיידקים המשמשים להתיישבות.
6. באמצעות קצה פיפטה המצופה במאגר תולעים M9 בתוספת 0.01% טריטון X-100 (M9TX-01), תולעי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהתולעים מושהות ביסודיות במדיום S, ואז מעבירות לצינורות או לבארות צלחת להתיישבות חיידקים.
7. הוסף תרחיף חיידקים לכל תרבית תולעים כדי להגיע לריכוז החיידקים הרצוי ולנפח הסופי.
8. אם משתמשים בצלחת מרובת בארות להתיישבות, יש לכסות את הצלחת בקרום איטום סטרילי חדיר גז בן 96 בארות.
9. דגירה עם טלטול ב-200 סל"ד כדי למנוע מחיידקים להתיישב במהלך הדגירה.

2. שיבוש מכני של תולעים בודדות בפורמט של 96 בארות

הערה: סעיף זה מתאר פרוטוקול בפורמט צלחת של 96 בארות לשיבוש מכני של C. elegans בודדים שעברו התיישבות חיידקית. השלבים הראשונים בפרוטוקול מתארים שיטה לטיהור חיידקים שאינם נדבקים ממעי התולעת וניקוי החלק החיצוני של התולעים באמצעות שיתוק קר והלבנת פני השטח. צעדים אלה ייצרו תולעים בוגרות נקיות וחיות שניתן לשבש מכנית לכימות תכולת חיידקים או להשתמש בהן לניסויים נוספים. ניתן להתאים פרוטוקול זה לכימות חיידקים בתולעים שהתיישבו בתרבית נוזלית, על צלחות אגר או מאדמה טבעית או מיקרוקוסמוס.

1. הניחו כמות של M9TX-01 על קרח לצינון (פי 4-5 ממספר הדגימות במ"ל).
2. הכינו מנה של M9TX-01 + אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט, 1:1000 או 1:2000 וולט/נפט, 1 מ"ל לדגימה + 1 מ"ל נוספים) והניחו על קרח לצינון.
3. השעו מחדש כל דגימת תולעת ב-1 מ"ל של M9TX-01 בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
4. סובב צינורות לזמן קצר (2-3 שניות) במיני-צנטריפוגה במהירות נמוכה (2,000 x גרם) ב-25 מעלות צלזיוס כדי לגלול בוגרים. פיפטה מהסופרנטנט והשליכו, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התולעת.
5. באמצעות צנטריפוגה, שטפו תולעים פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01, ואז פעם אחת עם 1 מ"ל של מאגר תולעים M9, כדי להפחית חיידקים חיצוניים.
6. לטהר חיידקים שאינם נדבקים ממעי התולעת.
   1. השעו מחדש כל דגימה של תולעים ב-1 מ"ל של S medium + 2x OP50 מומת חום בצינור תרבית.
   2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר מעבר של חיידקים שאינם נדבקים מהמעיים.
      הערה: זה גם יטהר כל חלבון פלואורסצנטי חוץ-תאי מהלומן ויאפשר הדמיה ברורה יותר של חיידקים מסומנים המודבקים לאפיתל המעי, במיוחד כאשר משתמשים בפלואורופורים מהירים חומצה (למשל, mCherry, dsRed).
7. תולעי אקונומיקה על פני השטח לניקוי חיידקים חיצוניים.
   1. שטפו תולעים מטוהרות פעמיים עם 1 מ"ל M9TX-01 קר והשליכו את הסופרנטנט.
   2. הניחו לצינורות להתקרר במשך 10 דקות על קרח (עדיף) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זה ישתק תולעים וימנע בליעת אקונומיקה.
      הערה: פרוטוקולים אחרים משתמשים בחומר שיתוק כימי כגון לבאמיסול; זוהי גישה מבוססת הדורשת תוספת של זרם פסולת מסוכנת.
   3. הוסף 1 מ"ל של מאגר תולעים M9 קר כקרח + אקונומיקה ללא ריח (8.25% נתרן הידרוקסיד, 1:1000 או 1:2000 v/v) לכל צינור. אפשר לצינורות לשבת על קרח (עדיף) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות כדי להרוג חיידקים חיצוניים.
      הערה: אין לחרוג מריכוז של 1:1000 אקונומיקה. אפילו בתולעים משותקות, עלולה להיגרם תמותה.
   4. פיפטה מאגר אקונומיקה ולזרוק; החזר את הצינורות לקרח כדי להבטיח שתולעים לא יחדשו את השאיבה עד לפינוי האקונומיקה.
   5. הוסף 1 מ"ל M9TX-01 קר לכל צינור. סיבוב במשך ~5 שניות במיני-צנטריפוגה (2,000 x גרם ב-25 מעלות צלזיוס); מחזירים את הצינורות לקרח. יש להסיר את החומר הנוזלי ולהשליך.
   6. חזור על שלב שטיפה זה עם עוד 1 מ"ל של M9TX-01 קר, והשליך כמה שיותר מהסופרנטנט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אקונומיקה, מסחרית, 8.25% נתרן היפוכלוריט	קלורוקס
סידן כלוריד דיהידראט	פישר סיינטיפיק	AC423525000
כולסטרול	VWR	AAA11470-30
חומצת לימון מונוהידראט	פישר סיינטיפיק	AC124910010
נחושת (II) סולפט פנטהידראט	פישר סיינטיפיק	AC197722500
קורנינג 6765 LSE מיני מיקרוצנטריפוגה	קורנינג	קור-6765
צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf 1.5 מ"ל, טבעיים	אפנדורף
מיקרוצנטריפוגה Eppendorf 5424R	אפנדורף	5406000640	מיקרו-צנטריפוגה ספסלית מקוררת ל-24 מקומות
צנטריפוגה Eppendorf 5810R עם רוטור S-4-104	אפנדורף	22627040	צנטריפוגה ספסלית 3 ליטר עם מתאמים לצינורות וצלחות 15-50 מ"ל
דלי צלחת אפנדורף (x2), לרוטור S-4-104	אפנדורף	22638930
אתנול 100%	פישר סיינטיפיק	BP2818500
ברזל (II) סולפט הפטהידראט	פישר סיינטיפיק	423731000
מגנזיום גופרתי הפטהידרט	פישר סיינטיפיק	AC124900010
מנגן (II) כלוריד טטרהידרט	VWR	470301-706
פפטון	פישר סיינטיפיק	BP1420-500
תמיסת מלח עם חוצץ פוספו (1X PBS)	ביוגרפיית זהב	פ-271-200
מגש חיטוי פוליפרופילן, רדוד	פישר סיינטיפיק	13-361-10
אשלגן הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	AC134062500
אשלגן פוספט דו-בסיסי	פישר סיינטיפיק	BP363-1
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	פישר סיינטיפיק	BP362-1
מרית מעבדה מסוג סקופ, מתכת	VWR	470149-438
נתרן הידרוקסיד	VWR	BDH7247-1
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים	פישר סיינטיפיק	BP332-500
סודום כלוריד	פישר סיינטיפיק	BP358-1
תלת-אשלגן ציטראט מונוהידראט	פישר סיינטיפיק	AC611755000
טריטון X-100	פישר סיינטיפיק	BP151-100
אבץ גופרתי הפטהידראט	פישר סיינטיפיק	AC205982500