שיבוש מכני של תולעים בודדות להערכת שונות באינטראקציות בין חיידקים מארחים

תקציר

מקור: טיילור, מ. נ. ואחרים. שימוש בנתוני תולעת בודדת כדי לכמת הטרוגניות באינטראקציות חיידקיות-חיידקיות Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הכימות של שונות העומס החיידקי במעי ב- Caenorhabditis elegans בודדים באמצעות שיבוש מכני. הוא מתאר את השלבים להכנת דגימה, שיבוש מכני, דילול סדרתי וספירת מושבות כדי להעריך את ההבדלים בעומס חיידקי המעיים בין תולעים בודדות.

פרוטוקול

1. הפרד תולעים לצלחת עמוקה של 96 בארות עם חצץ סיליקון קרביד לשיבוש מכני. הכן את לוחית השיבוש של 96 הבארות באופן הבא.
   1. השג צלחת סטרילית של 2 מ"ל באר עמוקה 96 בארות וכיסוי צלחת סיליקון תואם 96 בארות.
      הערה: חשוב להשתמש בפלטות התואמות את מתאמי 96 הבארות למשבש הרקמות. הבדלים זעירים במידות החיצוניות עושים את ההבדל בין צלחת שניתן להסיר מהמתאמים לבין צלחת שלא.
   2. בעזרת מרית כף סטרילית, הוסף כמות קטנה של סיליקון קרביד סטרילי 36 גריט לכל באר בצלחת שתקבל תולעת. השתמש במספיק חצץ כדי לכסות בקושי את תחתית הבאר (כ -0.2 גרם לבאר). חומר מוגזם יקשה על קבלת קצה פיפטה לתחתית הבאר בעת אחזור התכולה.
   3. הוסף 180 מיקרוליטר של מאגר תולעת M9 לכל באר.
   4. סמן את העמודות או השורות כדי לציין לאן כל דגימה תלך, ולאחר מכן כסה את הצלחת באופן רופף במכסה צלחת הסיליקון 96 בארות.
2. העבירו תולעים בודדות לצלחת 96 הבארות לשיבוש.
   1. העבירו תולעים חדירות בזהירות לצלחת פטרי קטנה (35 או 60 מ"מ) המכילה מספיק מאגר תולעים M9 בתוספת 0.01% Triton X-100 (M9TX-01) כדי למלא את הכלי לעומק של ~1 ס"מ.
      הערה: אם יש מספר רב של תולעים, ייתכן שלא ניתן יהיה להעביר את הדגימה כולה מכיוון שהנוזל יהפוך צפוף, ויהיה קשה לזרוק תולעים בודדות.
   2. באמצעות מיקרוסקופ מנתח או מכשיר אחר בהגדלה נמוכה, פיפטה תולעים בודדות בנפחים של 20 מיקרוליטר והעבירו את התולעים הללו לבארות בודדות של לוח 96 הבארות.
      הערה: עדיף לקצור רק תולעים טריות שנהרגו. הימנע מתולעים בעלות צורה קשיחה וליניארית, מכיוון שתולעים אלה עשויות להיות מתות מזה זמן מה. נסה לקחת תולעים מעוקלות או בצורת S, עם פיזיולוגיה גסה תקינה ומעי שלם.
   3. לאחר העברת כל נפח, ודא שהתולעת שנבחרה אכן נפלטה לבאר. לשם כך, פיפטה 20 מיקרוליטר של M9TX-01 מאזור ברור של צלחת הפטרי ושחרר את הנפח המלא בחזרה למנה; זה בדרך כלל יפלוט את התולעת אם היא נדבקת לפיפטה. אם התולעת נתקעה, הוציאו 20 מיקרוליטר מהבאר ונסו שוב את ההעברה.
   4. לאחר העברת כל התולעים, כסה את צלחת 96 הבארות בגיליון של סרט איטום גמיש עם גב נייר זמין מסחרית (2 x 2 ריבועים), וודא שהצד מגובה הנייר של סרט האיטום פונה כלפי מטה אל בארות הדגימה. היזהר לא למתוח את סרט האיטום דק מדי, אחרת יהיה קשה מאוד להסיר אותו מאוחר יותר.
   5. הנח את שטיח האיטום מסיליקון קלות על גבי סרט האיטום הגמיש; אל תלחץ את המכסה כלפי מטה לתוך הבארות בשלב זה.
   6. מעבירים את הצלחת ל -4 מעלות צלזיוס לצינון למשך 30-60 דקות. זה ימנע התחממות יתר במהלך שיבוש, מה שעלול לפגוע בדגימות.
      הערה: זוהי נקודת שבירה בפרוטוקול. ברוב המקרים ניתן להשאיר את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 4 שעות לפני הטחינה. אל תשאיר את התולעים למשך הלילה, מכיוון שהדבר ישנה את ספירת החיידקים.
3. טען צלחות של 96 בארות על משבש רקמות כדי לפרק רקמות תולעת ולשחרר חיידקי מעיים.
   הערה: (אופציונלי) אם משתמשים במספר אי זוגי של צלחות 96 בארות לעיכולים, יש צורך להכין משקל נגד לפני שתמשיך. השתמש בצלחת עמוקה ריקה של 96 בארות ומלא בארות במים עד שהיא שוקלת כמו הצלחת הראשונה.
   1. לחץ את שטיח האיטום מסיליקון כלפי מטה בחוזקה לתוך הבארות כדי ליצור איטום, וודא שהמכסה מונח שטוח על פני כל שטח הצלחת.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש עבה מדי לאחר המתיחה, יהיה קשה לאבטח את מכסה הסיליקון כך שהוא ישכב שטוח בכל הבארות. זה יביא לאיטום לא מספיק ולזיהום באר לבאר במהלך הטלטול.
   2. אבטח את הצלחות במשבש הרקמות באמצעות מתאמי הצלחות עם 96 בארות. לנער את הצלחות למשך דקה אחת ב-30 הרץ, ואז לסובב את הצלחות ב-180 מעלות ולנער שוב למשך דקה אחת. זה יעזור להבטיח שיבוש אחיד בכל בארות הצלחת.
   3. הקש בחוזקה על הצלחות על הספסל פעמיים או שלוש כדי לעקור כל חצץ מסרט האיטום הגמיש.
   4. בעזרת צנטריפוגה גדולה עם שני מתאמי צלחות של 96 בארות, סובב את הצלחות כלפי מטה ב-2400 x גרם למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל החומר לתחתית הבארות.
   5. הסר את מכסה הסיליקון ומשוך בזהירות את סרט האיטום הגמיש.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש נדבק באחת מהבארות, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר אותו. זה נפוץ כאשר סרט האיטום הגמיש נמתח דק מדי.
4. דגימות עיכול תולעים מדוללות באופן סדרתי ב-300 מיקרוליטר בצלחות של 96 בארות.
   1. בעזרת פיפטור רב בארות המוגדר ל -200 מיקרוליטר, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לאט ובזהירות כדי לערבב מחדש את תכולת הבארות, ואז לשאוב כמה שיותר מהנוזל. העבירו את הנוזל הזה לשורות העליונות של צלחות 96 הבארות שהוכנו לדילול סדרתי של דגימות תולעים משובשות.
   2. בעזרת פיפטור של 96 בארות המוגדר ל-20 מיקרוליטר, הסר את נפח הנוזל הזה מהשורה העליונה והוציא לשורה B. פיפטה למעלה ולמטה פי 8-10 לערבוב. השלך טיפים.
   3. חזור על שלב 4.2, החל מהדגימות של 0.1x בשורה B כדי ליצור דגימות דילול של 0.01x בשורה C.
   4. חזור על שלב 4.2 שוב, ועבור משורה C לשורה D.
   5. צלחת על אגר מוצק לכימות חיידקים. עבור תולעים חד-מושבות, בדרך כלל מספיק לצלחת 10-20 טיפות מיקרוליטר מכל דילול [1x-0.001x] על צלחות אגר. להתיישבות מרובת מינים, צלחו כל דילול בנפרד על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר על צלחת אגר בגודל 10 ס"מ; מורחים מיד בעזרת חרוזי ציפוי זכוכית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שטיח איטום צלחות 96 בארות, סיליקון, בארות מרובעות (AxyMat)	אקסיג'ן	AM-2 מ"ל-מ"ר
צלחות 96 בארות, 2 מ"ל, בארות מרובעות	אקסיג'ן	פ-2מ"ל-מ"ק-ק-ש
מכסי צלחת פוליפרופילן 96 בארות	אוורגרין מעבדה	290-8020-03 ליטר
אגר	פישר סיינטיפיק	443570050
סט מתאם טחנת חרוזים לצלחות 96 בארות	קיאג'ן	119900	לוחות מתאם לשימוש עם שתי צלחות 96 בארות ב-TissueLyser II
הומוגנייזר רקמות טחנת חרוזים (TissueLyser II)	קיאג'ן	85300	הומוגנייזר מכני לשיבוש דגימה בתפוקה בינונית עד גבוהה
Breathe-Easy 96 בארות קרום איטום חדיר גז	ביוטכנולוגיה מגוונת	BEM-1	ממברנות פוליאוריטן חדירות לגז Multiwell. סרט איטום דק חדיר ל-O₂, CO₂ ואדי מים והוא שקוף UV עד 300 ננומטר. סטרילי, 100/קופסה.
צנטריפוגה Eppendorf 5810R עם רוטור S-4-104	אפנדורף	22627040	צנטריפוגה ספסלית 3 ליטר עם מתאמים לצינורות וצלחות 15-50 מ"ל
דלי צלחת אפנדורף (x2), לרוטור S-4-104	אפנדורף	22638930
כלי פטרי, עגולים, 10 ס"מ	VWR	25384-094