כימות קוטביות ודינמיקה של רכיב מערכת הפרשה בלגיונלה פנאומופילה

תקציר

מקור: Chetrit, D., et al. יישום הדמיית תאים חיים וטומוגרפיה קריו-אלקטרונית כדי לפתור מאפיינים מרחביים-זמניים של מערכת ההפרשה Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים כדי לכמת את הקוטביות והדינמיקה של רכיבי מערכת ההפרשה ב-Legionella pneumophila, ומאפשר ניתוח של גיוס מרחבי וחלוקה מחדש ציטוזולית קריטית להבנת פתוגנזה חיידקית

פרוטוקול

1. כימות לוקליזציה קוטבית ודינמיקה של רכיבי נקודה/ICM

הערה: השלבים הבאים מיועדים לתמונות עם 0.129 מיקרומטר לפיקסל שנרכשו עם 2 x 2 binning.

1. כימות הקוטביות עבור חלבוני היתוך sfGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) (איור 1)
   1. התאימו את ניגודיות התמונה כך שהחיידקים ייראו בבירור. השתמש בכלי האזור כדי למקם מלבן של 0.25 x 1.3 מיקרומטר² המתחיל בקוטב ונמשך לתוך הציטופלזמה. המלבן חייב להישאר בדיוק בתוך גבולות החיידקים.
   2. סמן לפחות 200 חיידקים והשתמש בלחצן אזור למסכה כדי ליצור מסכות עבור אזורי העניין. תחת סטטיסטיקת מסיכה וטווח מסיכה, בחר אובייקט. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, סמן עוצמה ממוצעת ושונות.
   3. ייצא את הנתונים וחשב את ציוני הקוטביות של כל חיידק כיחס בין השונות לעוצמה הממוצעת.
   4. עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה, השתמש במטרת פאזה ובהגדרת מעבה מתאימה כדי לרכוש תמונות עם ערוצי הפאזה ו-488 ננומטר. הקפד לבחור שדות ראייה שבהם החיידקים מופרדים לחלוטין.
   5. התאם את ניגודיות ערוץ הפאזה של התמונה לרמה שבה החיידקים נראים בבירור. פתחו את התמונה הדו-ערוצית, הפעילו את החלון Create Segment Mask ושנו את הערוץ לשלב.
   6. התאימו סף מתאים והסירו עצמים קטנים בעזרת הלחצן Define Objects . תחת Refine Mask, בחרו Remove Edges Objects, ולאחר מכן מסיכות נפרדות של חיידקים הסמוכים זה לזה.
   7. חשב את ציוני הקוטביות של האות בערוץ 488 עבור כל תא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 1.1.2-1.1.3.
2. כימות דינמיקה עבור חלבוני היתוך sfGFP (איור 2)
   הערה: דינמיקה מוגדרת כשינויים בעוצמה לאורך זמן, והשלבים הבאים מיועדים לפרקי הדמיה קצרים (כלומר, מספר דקות). הוסף למשטח את התוספים המתאימים אם רוצים תקופות הדמיה ארוכות יותר.
   1. בחלון לכידת תמונה , סמן Timelapse, הזן את זמן המרווחים בתיבה מרווח והזן 2 בתיבה # של נקודות זמן . רכוש שתי תמונות עוקבות של לגיונלה פנאומופילה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי המעניין.
   2. התאם את ניגודיות התמונה עד שהתאים יהיו גלויים בבירור. עקבו אחר איור 2A והתיאורים למטה כדי למקם שלוש מסכות שונות. השתמשו בכלי region כדי למקם ריבוע בגודל 0.25 x 0.25 מיקרומטר באמצע 400 תאים לפחות.
   3. השתמשו בלחצן Region to Mask ליצירת מסיכה (מסיכה 1) של הריבועים המעניינים. צור מסיכה ריקה חדשה (מסיכה 2) והשתמש בכלי הפיקסלים או בכלי המצולע כדי לסמן את כל שטח התא של לפחות 25 תאים אקראיים, שישמשו לחישוב הלבנת הקרינה. צרו מסיכה ריקה חדשה (מסיכה 3) והשתמשו בכלי המברשת הגדולה לסימון אזורים בין התאים, שישמשו להפחתת רקע.
   4. תחת Mask Statistics and Mask Scope, בחר Object עבור מסיכה 1 ומסיכה 2. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, בחר עוצמה ממוצעת וייצא את הנתונים של שתי המסכות. עבור מסכה 3, ייצא את העוצמה הממוצעת של המסכה כולה.
   5. חשב את השינוי בעוצמת הקרינה עבור כל אובייקט במסיכה 1 באמצעות הנוסחאות הבאות:

כאשר מסכה 1 היא ריבוע של 0.25 מיקרומטר × 0.25 מיקרומטר הממוקם במרכז התא, מסכה 2 מכסה את כל התא, מסכה 3 היא הרקע בין התאים, T1 היא העוצמה הממוצעת בנקודת הזמן הראשונה, ו-T2 היא העוצמה הממוצעת בנקודת הזמן השנייה.

תוצאות

איור 1: כימות לוקליזציה קוטבית של תת-יחידות מערכת Dot/Icm. (A) הדמיה בזמן אמת של DotB-sfGFP שבאה לידי ביטוי ב-Lp01 הראתה לוקליזציה קוטבית. DotB-sfGFP הציג דפוס מפוזר כאשר הוא מתבטא בזן שבו כל אשכול הגנים dot/icm

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יעד 100x Plan Apo (1.4 NA)	ניקון
מצלמת שחור-לבן דיגיטלית CoolSNAP EZ 20 מגה-הרץ	פוטומטריה
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ 22x22 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-542ב
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ 24x50 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-545 אלף
שקופיות מיקרוסקופ 25x75x1 מ"מ	גלוב סיינטיפיק	1380
ספר שקופיות 6.0	חידושים בהדמיה חכמה
מנוע אור Spectra X	לומנקור