$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. כימות לוקליזציה קוטבית ודינמיקה של רכיבי נקודה/ICM
הערה: השלבים הבאים מיועדים לתמונות עם 0.129 מיקרומטר לפיקסל שנרכשו עם 2 x 2 binning.
- כימות הקוטביות עבור חלבוני היתוך sfGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) (איור 1)
- התאימו את ניגודיות התמונה כך שהחיידקים ייראו בבירור. השתמש בכלי האזור כדי למקם מלבן של 0.25 x 1.3 מיקרומטר2 המתחיל בקוטב ונמשך לתוך הציטופלזמה. המלבן חייב להישאר בדיוק בתוך גבולות החיידקים.
- סמן לפחות 200 חיידקים והשתמש בלחצן אזור למסכה כדי ליצור מסכות עבור אזורי העניין. תחת סטטיסטיקת מסיכה וטווח מסיכה, בחר אובייקט. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, סמן עוצמה ממוצעת ושונות.
- ייצא את הנתונים וחשב את ציוני הקוטביות של כל חיידק כיחס בין השונות לעוצמה הממוצעת.
- עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה, השתמש במטרת פאזה ובהגדרת מעבה מתאימה כדי לרכוש תמונות עם ערוצי הפאזה ו-488 ננומטר. הקפד לבחור שדות ראייה שבהם החיידקים מופרדים לחלוטין.
- התאם את ניגודיות ערוץ הפאזה של התמונה לרמה שבה החיידקים נראים בבירור. פתחו את התמונה הדו-ערוצית, הפעילו את החלון Create Segment Mask ושנו את הערוץ לשלב.
- התאימו סף מתאים והסירו עצמים קטנים בעזרת הלחצן Define Objects . תחת Refine Mask, בחרו Remove Edges Objects, ולאחר מכן מסיכות נפרדות של חיידקים הסמוכים זה לזה.
- חשב את ציוני הקוטביות של האות בערוץ 488 עבור כל תא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 1.1.2-1.1.3.
- כימות דינמיקה עבור חלבוני היתוך sfGFP (איור 2)
הערה: דינמיקה מוגדרת כשינויים בעוצמה לאורך זמן, והשלבים הבאים מיועדים לפרקי הדמיה קצרים (כלומר, מספר דקות). הוסף למשטח את התוספים המתאימים אם רוצים תקופות הדמיה ארוכות יותר.- בחלון לכידת תמונה , סמן Timelapse, הזן את זמן המרווחים בתיבה מרווח והזן 2 בתיבה # של נקודות זמן . רכוש שתי תמונות עוקבות של לגיונלה פנאומופילה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי המעניין.
- התאם את ניגודיות התמונה עד שהתאים יהיו גלויים בבירור. עקבו אחר איור 2A והתיאורים למטה כדי למקם שלוש מסכות שונות. השתמשו בכלי region כדי למקם ריבוע בגודל 0.25 x 0.25 מיקרומטר באמצע 400 תאים לפחות.
- השתמשו בלחצן Region to Mask ליצירת מסיכה (מסיכה 1) של הריבועים המעניינים. צור מסיכה ריקה חדשה (מסיכה 2) והשתמש בכלי הפיקסלים או בכלי המצולע כדי לסמן את כל שטח התא של לפחות 25 תאים אקראיים, שישמשו לחישוב הלבנת הקרינה. צרו מסיכה ריקה חדשה (מסיכה 3) והשתמשו בכלי המברשת הגדולה לסימון אזורים בין התאים, שישמשו להפחתת רקע.
- תחת Mask Statistics and Mask Scope, בחר Object עבור מסיכה 1 ומסיכה 2. לאחר מכן, תחת תכונות ועוצמה, בחר עוצמה ממוצעת וייצא את הנתונים של שתי המסכות. עבור מסכה 3, ייצא את העוצמה הממוצעת של המסכה כולה.
- חשב את השינוי בעוצמת הקרינה עבור כל אובייקט במסיכה 1 באמצעות הנוסחאות הבאות:
כאשר מסכה 1 היא ריבוע של 0.25 מיקרומטר × 0.25 מיקרומטר הממוקם במרכז התא, מסכה 2 מכסה את כל התא, מסכה 3 היא הרקע בין התאים, T1 היא העוצמה הממוצעת בנקודת הזמן הראשונה, ו-T2 היא העוצמה הממוצעת בנקודת הזמן השנייה.
