הסרטון מתאר כיצד להכין דגימות לגיונלה פנאומופילה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית על ידי שילוב של תרבית חיידקים, סימון ננו-חלקיקי זהב וטכניקות זיגוג. התהליך משמר מבנים תאיים טבעיים ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של רכיבי מערכת ההפרשה הקשורים לממברנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת לגיונלה פנאומופילה לטומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית
375 צפיות
⸱
30 באוקטובר 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. זיהוי צפיפות מסה sfGFP עם Cryo-ET
1. הכנת דגימות, איסוף נתונים ושחזור
1. לגדל כתם כבד של Legionella pneumophila המבטא חלבון Dot/Icm מתויג פלואורסצנטי על צלחות CYE-agar-streptomycin למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מיקרוליטר של חלקיקי זהב קולואידים (BSA Tracer, 10 ננומטר) ל-20 מיקרוליטר של תרחיף התא.
2. פיפטה 5 מיקרוליטר מתערובת התאים על רשת פחמן חור שנפרקה בזוהר טרי (R 2/1 על רשת Cu 200) והניחו לעמוד למשך דקה אחת. כתם בנייר סינון והקפיא באתאן נוזלי באמצעות מכשיר בוכנה מונע כוח הכבידה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חלקיקי זהב קולואידיים 10 ננומטר | אוריון | 25486 | |
| יעד 100x Plan Apo (1.4 NA) | ניקון | ||
| אסים | סיגמא-אולדריץ' | א9758 | |
| מצלמת שחור-לבן דיגיטלית CoolSNAP EZ 20 מגה-הרץ | פוטומטריה | ||
| מסגרת גנים, 1.7x2.8 ס"מ, 125 מיקרוליטר | פישר סיינטיפיק | AB-0578 | |
| רשת פחמן Holey R 2/1 Cu 200 רשת | קוונטיפויל | Q225-CR1 | |
| ברזל (III) חנקתי נונאהידראט | סיגמא-אולדריץ' | 216828 | |
| מצלמת K2 Summit עבור cryo-EM | גתן | ||
| שקופיות כיסוי מיקרוסקופ 22x22 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 12-542ב | |
| שקופיות כיסוי מיקרוסקופ 24x50 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 12-545 אלף | |
| שקופיות מיקרוסקופ 25x75x1 מ"מ | גלוב סיינטיפיק | 1380 | |
| ספר שקופיות 6.0 | חידושים בהדמיה חכמה | ||
| מנוע אור Spectra X | לומנקור |
תגיות
