גידול החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות

תקציר

מקור: Wiegand, D. J., Lee, et al., ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הגידול והקציר של Vibrio natriegens, חיידק הגדל במהירות, בתנאים מאווררים להכנת כדורי חיידקים לייצור תמצית גולמית.

פרוטוקול

הכנת תמצית תאים גולמיים Vibrio natriegens – תרבית חיידקים

1. הכן את אמצעי גידול החיידקים V. natriegens LB-V2 (מרק ליזוגני עם מלחי V2) לפי טבלה 1. עקר את מצע הגידול על ידי חיטוי. אפשר למדיה להגיע לטמפרטורת החדר (RT). אחסן מדיה עודפת ב-RT.
   זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ולהתייעץ עם הוראות ספציפיות למעבדה בעת הפעלת חיטוי.
2. השתמש במלאי גליצרול של V. natriegens מסוג בר כדי לחסן 3 מ"ל של מדיה LB-V2. יש לגדול במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות של 225 סל"ד.
3. שטפו 1 מ"ל מתרבית הלילה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,600 x גרם על צנטריפוגה ספסל למשך דקה. שאפו את ה-supernatant מבלי להפריע לגלולה המתקבלת והשעו מחדש ב-1 מ"ל של מדיה LB-V2 טרייה.
4. בבקבוק Erlenmeyer מבולבל בנפח 4 ליטר עם כיסוי סטרילי, הוסף 1 ליטר של מצע גידול LB-V2 טרי. יש לחסן באמצעות 1 מ"ל תרבית לילה שטופה (יחס דילול של 1:1,000). לגדל תרבית ב-30 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-225 סל"ד.
   הערה: ניתן להגדיל או להקטין את תרביות V. natriegens תוך שמירה על יחס דילול של 1:1,000. לדוגמה, הוסף 250 מיקרוליטר של תרבית לילה שטופה ל-250 מ"ל של מצע גידול LB-V2 טרי בבקבוק ארלנמאייר מבולבל של 2 ליטר עם כיסוי סטרילי.
5. עקוב אחר OD₆₀₀ של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר התרבית מגיעה ל-OD₆₀₀ = 1.0 ±-0.2, קצרו תרבית באמצעות צנטריפוגה ב-3,500 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: V. natriegens גדל במהירות, ולכן יש צורך במעקב צמוד אחר התרבית. צמיחה ל-OD₆₀₀ = 1.0 אמורה להימשך כ-1.5-2 שעות ביחס דילול של 1:1,000.
6. שאפו את הסופרנטנט ואחסנו מיד את הגלולה החיידקית שנוצרה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או המשיכו ישירות לליזה של תאים.
   הערה: שלב זה הוא נקודת עצירה טובה; עם זאת, מומלץ לעבד את הגלולה באופן מיידי או תוך 1-2 ימים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

טבלה 1: ריאגנטים להכנת 1 ליטר של מצע גידול חיידקים LB-V2

טבלה 1 א	הכנת מצע גידול חיידקים LB-V2
רכיב	כמות (גרם)	ריכוז סופי (מ"מ)	כרך סופי (L)
מרק LB (מילר)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
טבלה 1 ב	הכנת מאגר ליזה S30A
רכיב	כמות (גרם)	ריכוז סופי (מ"מ)	כרך סופי (L)
תמיסת טריס (pH 8.0) - 1 מ' (מ"ל)	25	50	0.5
מ"ג-גלוטמט	2.72	14
K-גלוטמט	6.10	60
דיתיותרייטול (DTT) - 1 מ' (מ"ל)	1	2

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות 2 מ"ל	אפנדורף	22363352
HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-חומצה פיפרזינאתי-סולפונית)	סיגמא	H3375
מרק LB (לוריא-ברטני) (מילר)	סיגמא	L3522
מגנזיום כלוריד (MgCl₂)	סיגמא	M8266
אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא	עמ' 9333
נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא	S7653
תמיסת טריס (pH 8.0) - 1 מ'	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (סוג פראי) ציר ליופילי	ATCC	14048