הכנת תמצית תאים גולמיים מ-Vibrio natriegens

תקציר

מקור: Wiegand, D. J., et al. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות. J . Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את הכנת תמצית התאים מ-Vibrio natriegens, חיידק הגדל במהירות הידוע בקצב סינתזת החלבון הגבוה שלו. הגלולה החיידקית נשטפת ומושעה מחדש במאגר ליזה לפני סוניקציה על קרח כדי למנוע פירוק תאי. הליזאט עובר צנטריפוגה כדי להפריד פסולת תאים בלתי מסיסה, ותמצית התאים נאספת, מוקפאת ומאוחסנת לשימוש עתידי.

פרוטוקול

1. הכנת תמציות תאים גולמיים של V. natriegens – תרבית חיידקים

1. הכן את אמצעי גידול החיידקים V. natriegens , מרק ליזוגני גרסה 2 (LB-V2) לפי טבלה 1. עקר את מצע הגידול על ידי חיטוי. אפשר למדיה להגיע לטמפרטורת החדר (RT). אחסן מדיה עודפת ב-RT.
   זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ולהתייעץ עם הוראות ספציפיות למעבדה בעת הפעלת חיטוי.
2. השתמש במלאי גליצרול של V. natriegens מסוג בר כדי לחסן 3 מ"ל של מדיה LB-V2. יש לגדול במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות של 225 סל"ד.
3. שטפו 1 מ"ל מתרבית הלילה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,600 x גרם על צנטריפוגה ספסל למשך דקה. שאפו את ה-supernatant מבלי להפריע לגלולה המתקבלת והשעו מחדש ב-1 מ"ל של מדיה LB-V2 טרייה.
4. בבקבוק ארלנמאייר מבולבל בנפח 4 ליטר עם כיסוי סטרילי, הוסף 1 ליטר של מצע גידול LB-V2 טרי. יש לחסן באמצעות 1 מ"ל תרבית לילה שטופה (יחס דילול של 1:1,000). לגדל תרבית ב-30 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-225 סל"ד.
   הערה: ניתן להגדיל או להקטין את תרביות V. natriegens תוך שמירה על יחס דילול של 1:1,000. לדוגמה, הוסף 250 מיקרוליטר של תרבית לילה שטופה ל-250 מ"ל של מצע גידול LB-V2 טרי בבקבוק ארלנמאייר מבולבל של 2 ליטר עם כיסוי סטרילי.
5. עקוב אחר OD₆₀₀ של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר התרבות מגיעה ל-OD₆₀₀ = 1.0 ±-0.2, קצרו תרבית באמצעות צנטריפוגה ב-3,500 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: V. natriegens גדל במהירות, ולכן יש צורך במעקב צמוד אחר התרבית. צמיחה ל-OD₆₀₀ = 1.0 אמורה להימשך כ-1.5-2 שעות ביחס דילול של 1:1,000.
6. שאפו את הסופרנטנט ואחסנו מיד את הגלולה החיידקית שנוצרה ב-80 מעלות צלזיוס או המשיכו ישירות לליזה של תאים המתוארים בסעיף 2.
   הערה: שלב זה הוא נקודת עצירה טובה; עם זאת, מומלץ לעבד את הגלולה באופן מיידי או תוך 1-2 ימים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

2. הכנת תמציות תאים גולמיים של V. natriegens - ליזיס תאים

1. הכן מאגר ליזה S30 לפי טבלה 1 במים סטריליים נטולי יונים (DI) והתאם את ה-pH ל-7.7 באמצעות חומצה אצטית קרחונית
   זהירות: יש לטפל בחומצה אצטית קרחונית עם PPE מתאים בעת התאמת ה-pH.
2. יש לקרר את מאגר הליזיס S30 לכ-4 מעלות צלזיוס במקרר או על קרח לפני תחילת הליך הליזיס של התאים.
   הערה: להתקררות מהירה, ניתן למקם את מאגר הליזיס בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. אל תאפשר למאגר לקפוא.
3. יש להניח את כדוריות התא על קרח למשך 10-20 דקות או עד להפשרה מלאה. השעו מחדש את כל הכדורים הנובעים מאותה תרבית של 1 ליטר באמצעות 10 מ"ל של מאגר ליזה S30 קר, ולאחר מכן העבירו את המתלה לצינור של 50 מ"ל. אם כדורים לא קפואים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בשלב 1.6, המשך ישירות להשעיה מחדש.
   הערה: הגדל את נפח מאגר הליזיס S30 המשמש להשעיה ראשונית של כדורים לפי הצורך.
4. תרחיף צנטריפוגה ב-3,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. שטפו את הגלולה בפעם השנייה באמצעות 10 מ"ל של מאגר ליזה S30 קר. הניחו את הכדור על קרח.
5. בחדר קר, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה S30 קר לגלולה בצינור של 50 מ"ל. בעזרת קצה פיפטה רחב, השעו מחדש את הגלולה והעבירו בזהירות את כל מתלה הגלולה לצינור של 2 מ"ל.
   הערה: אם פיפטה בעלת קדח רחב אינה זמינה, השתמש במספריים כדי לחתוך את קצה הפיפטה של 1 מ"ל כדי להגדיל את הקדח להעברת גלולה.
   1. העבירו כמה שיותר גלולה מבלי להגדיל משמעותית את הנפח; עם זאת, יש להשעות את הגלולה במספיק נוזל כדי להיות סוניקציה, כפי שמצוין על ידי מתלה הומוגני בצינור 2 מ"ל. אין למלא יתר על המידה את צינור 2 מ"ל. המתלה לא יעלה על 1.5 מ"ל; פיצול למספר צינורות במידת הצורך.
6. שמור את כדור התא על קרח ועבוד בחדר קר. מלאו של 600 מ"ל בקרח והניחו מחזיק צינור של 2 מ"ל על גבי הקרח.
   הערה: כדאי למקם את מחזיק הצינור ליד צד הכוס, כך שמתלה הגלולה יהיה גלוי בקרח כדי לעקוב אחר התקדמות הסוניקציה (ראה איור 1).
7. מערבולת תלתה כדור בצינור של 2 מ"ל לזמן קצר כדי להומוגניזציה של התאים, העבירו את הצינורות כדי להסיר את כל התאים בתחתית המכסה, והניחו לתוך מחזיק הצינור כשהמכסה פתוח. הורד את קצה הסוניקטור לתוך המתלה כך שיהיה ממש מתחת לפני הנוזל.
8. הכן את מערך הסוניקציה כפי שמתואר באיור 2 באמצעות סוניקטור ובדיקה בקוטר קצה של 1/8 אינץ'. הזן את ההגדרות הבאות לבקרת הסוניקטור: תדר 20 קילו-הרץ ו-50% משרעת, זמן הפעלה של דופק: 10 שניות, זמן כיבוי דופק: 60 שניות.
9. הפעל את פרוטוקול סוניקציה הדופק למשך שלושה מחזורים. אם הנפח הכולל של תרחיף הגלולה הוא >-500 מיקרוליטר, הפעל את פרוטוקול סוניקציה של הדופק שש פעמים.
   הערה: בדרך כלל, 3-6 פולסים מספיקים כדי לליז כדורי V. natriegens ; ייתכן שיידרשו פולסים נוספים בהתאם לסוניקטור. במהלך סוניקציה, השתמש בפלטפורמת כפתור הכוונון כדי להזיז את הגשושית למעלה ולמטה כדי לליז כל כדור שאולי התיישב בתחתית הצינור. ניתן להסיר את הצינור מהמחזיק ולסובב אותו לזמן קצר כדי להומוגניזציה מחדש של המתלה בין הפולסים.
   זהירות: ללבוש מגן שמיעה מתאים כאשר הסוניקטור פעיל.
10. לאחר סוניקציה, צנטריפוגה את תמצית התא הגולמי ב-16,000 x g למשך 30-45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס או עד שהליזאט נקי מכל פסולת תאית, כפי שמתואר באיור 3.
11. בחדר קירור, יש להוציא 50 מיקרוליטר מהסופרנטנטים המתקבלים לצינורות חדשים של 2 מ"ל מבלי להפריע לגלולה.
    הערה: כל פסולת המועברת בטעות לצינורות החדשים של 2 מ"ל תפחית באופן דרסטי את יכולת התמצית לסינתזת חלבון בעלת תפוקה גבוהה.
12. הקפאת בזק של תמציות תאים גולמיים על ידי הנחת צינורות לתוך מחזיק צינור עם חוט טבילה מחובר, כפי שמתואר באיור 4. טבלו צינורות לתוך דיואר המכיל חנקן נוזלי והכניסו אותם מיד למקפיא בחום של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. זהירות: השתמש בציוד הגנה אישי מתאים לטיפול בחנקן נוזלי, כולל חלוק מעבדה, משקפי בטיחות, מגן פנים, סינר קריוגן וכפפות.

טבלה 1: ריאגנטים להכנת 1 ליטר של אמצעי גידול חיידקים LB-V2 ו-0.5 ליטר של מאגר ליזה של תאים S30A.

טבלה 1 א	הכנת מצע גידול חיידקים LB-V2
רכיב	כמות (גרם)	ריכוז סופי (מ"מ)	כרך סופי (L)
מרק LB (מילר)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
טבלה 1 ב	הכנת מאגר ליזה S30A
רכיב	כמות (גרם)	ריכוז סופי (מ"מ)	כרך סופי (L)
תמיסת תריס (pH 8.0) - 1 מ' (מ"ל)*	25	50	0.5
מ"ג-גלוטמט	2.72	14
K-גלוטמט	6.10	60
דיתיותרייטול (DTT) - 1 מ' (מ"ל)*	1	2

תוצאות

איור 1: מבט מקרוב על הכוס ומחזיק הצינור על פלטפורמת הסוניקציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות 15 מ"ל	קורנינג	352196
צינורות 2 מ"ל	אפנדורף	22363352
צינורות 50 מ"ל	קורנינג	352070
בקבוק דיואר - 4 ליטר	תרמו-סיינטיפיק	10-194-100ג
חומצה L-גלוטמית, מלח המימגנזיום טטרהידרט	סיגמא	49605
L-חומצה גלוטמית מלח אשלגן מונוהידראט	סיגמא	G1149
מרק LB (מילר)	סיגמא	L3522
מגנזיום כלוריד (MgCl₂)	סיגמא	M8266
אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא	עמ' 9333
כדורי אשלגן הידרוקסיד	סיגמא/רוש	1050121000
Q125 סוניקטור ובדיקה CL-18	קסוניקה	4422
נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא	S7653
Vibrio natriegens (סוג פראי) ציר ליופילי	ATCC	14048