ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תמצית תאים גולמיים חיידקים

תקציר

מקור: Wiegand, D. J., et al. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את השימוש במערכת ביטוי חלבון נטולת תאים חיידקית המבוססת על Vibrio natriegens ליזאט גולמי לביצוע שעתוק ותרגום משולבים במבחנה. הוא מדגיש את הכנת תערובת המאסטר עם רכיבים חיוניים ואת הסינתזה שלב אחר שלב של חלבונים פונקציונליים מתבנית DNA.

פרוטוקול

1. הכנת רכיבי תגובה נטולי תאים

1. רכיבי תגובה כלליים
   1. הכן מלאי עבודה של Mg-glutamate ו-K-glutamate בצינורות של 50 מ"ל עם מים סטריליים DI (דה-יוניזציה) בריכוזים של 100 מ"מ ו-2000 מ"מ, בהתאמה.
   2. הכן מלאי עבודה של 50% (w/v) פוליאתילן גליקול (PEG)-8000 על ידי הוספת 100 מ"ל של מי DI סטריליים לכוס של 250 מ"ל. מניחים מערבל מגנטי קטן לתוך הכוס. שוקלים 50 גרם PEG-8000 ומוסיפים ל -100 מ"ל מים בכוס.
   3. מניחים את הכוס על צלחת ערבוב מחוממת המכוונת ל-100 מעלות צלזיוס ומערבבים בחום של 250 סל"ד עד ש-PEG-8000 בתמיסה. הניחו לתערובת הנוזלית PEG-8000 להתקרר לפני ההעברה לצינורות של 50 מ"ל.
2. תמהיל מאסטר של פתרונות אנרגיה
   1. הכן תמיסה של 5 M של KOH על ידי הוספת 140 גרם כדורי KOH ל-500 מ"ל מי DI סטריליים.
      זהירות: הכן תמיסה זו במכסה מנוע כימי ולבש PPE בעת טיפול בבסיסים חזקים. התמיסה תתחמם ולכן מכסה הבקבוק חייב להיות רופף כדי למנוע הצטברות לחץ. אפשר לפתרון KOH להגיע ל-RT לפני השימוש.
   2. הכן מאגר HEPES-KOH של 1750 מ"מ על ידי הוספת 20.85 גרם HEPES לבקבוק של 100 מ"ל. מוסיפים לאט לאט מי DI סטריליים עד שהנפח מגיע ל-40 מ"ל. בקבוק מערבולת להמסת HEPES. השתמש בתמיסת 5 M KOH כדי להתאים את ה-pH ל-8.0 ולאחר מכן להביא את נפח התמיסה ל-50 מ"ל.
      זהירות: יש לטפל ב-KOH עם PPE מתאים בעת התאמת ה-pH.
   3. הכן את רכיבי המלאי הנותרים של תערובת מאסטר אנרגיה פי 10 בריכוזים המצוינים בטבלה 1 במי DI סטריליים והניח כל ציר על קרח. הפשירו את מלאי ה-100 מ"מ ATP, GTP, CTP ו-UTP ב-RT והניחו על הקרח.
      הערה: ניתן להשתמש בתרמו-מיקסר המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-350 סל"ד כדי להמיס ריאגנטים לתמיסה במידת הצורך. אין לחמם יתר על המידה או להשאיר ריאגנטים על התרמו-מערבל למשך תקופה ממושכת.
   4. בצינור של 15 מ"ל, הוסף כל רכיב תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה בהתאם לסדר ולנפח המפורטים בטבלה 1. מערבולת את התמיסה לאחר הוספת כל רכיב. זה יהפוך 5 מ"ל של תמיסת מאסטר של פתרון אנרגיה פי 10.
   5. חלקו את תערובת המאסטר של תמיסת האנרגיה פי 10 ל-200 מיקרוליטר בצינורות של 2 מ"ל. הקפאת בזק כל קצוב. מכניסים מיד למקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. תערובת מאסטר של חומצות אמינו
   1. להכנת תערובת מאסטר טרייה פי 4 חומצות אמינו, התחל בהפשרת כל ציר חומצות אמינו ב-RT ולאחר מכן הנחת כל אחת על קרח. השתמשו במערבולת ו/או בתרמו-מיקסר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-350 סל"ד כדי להבטיח שכל מלאי חומצות האמינו מומס במלואו.
      הערה: ייתכן שציסטאין לא יתמוסס במלואו; ניתן להוסיף אותו לתערובת מאסטר של חומצות אמינו כתרחיף. אין לחמם יתר על המידה או להשאיר ריאגנטים על התרמו-מערבל למשך תקופה ממושכת.
   2. בשפופרת של 15 מ"ל, הוסף את הנפח המתאים של חומצות אמינו למי DI סטריליים כך שהריכוז הסופי של כל אחד מהם יהיה 8 מ"מ בסדר הבא: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU ו-CYS. לאחר הוספת כל חומצת אמינו, מערבל את תמיסת תערובת המאסטר. הנפחים המפורטים בטבלה 1 יהוו 2.4 מ"ל של תערובת מאסטר של חומצות אמינו.
   3. מחלקים את תערובת המאסטר של חומצות אמינו 4x ל-200 מיקרוליטר בצינורות של 2 מ"ל. הקפאת בזק כל קצוב. מכניסים מיד למקפיא בחום של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. ייצור תבנית DNA פלסמיד מוכנה לתגובה
   הערה: ביטוי חלבון נטול תאים במערכת זו עבר אופטימיזציה באמצעות וקטור ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) T7-pJL1-sfGFP (טבלת חומרים). מומלץ להשתמש בפלסמיד זה כבקרה ליעילות תגובה נטולת תאים ועמוד השדרה pJL1 לשיבוט וביטוי של רצפי חלבון אחרים. ניתן להשתמש בתבניות DNA אחרות של פלסמיד; עם זאת, חשוב לציין כי השעתוק נשלט על ידי רצף מקדם T7 ונוכחות של T7 RNA פולימראז. פרוטוקול פשוט לייצור בקנה מידה גדול של כל תבנית DNA פלסמיד מ - E. coli שעבר טרנספורמציה מתואר להלן.
   1. טהר את הווקטור הרצוי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). הערה: מומלץ לרכז את תבנית ה-DNA של הפלסמיד ככל האפשר כדי לעמוד באילוצי הנפח ההדוקים של התגובה נטולת התאים. באופן כללי, שאפו למלאי עבודה של 750-1500 ננוגרם/מיקרוליטר.

2. ביצוע תגובות ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות תמצית גולמית של V. natriegens

1. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות פלסמיד או תבנית DNA ליניארית
   1. הסר תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה פי 10 ותערובת מאסטר של חומצות אמינו פי 4 מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס, הפשיר ב-RT והניח על קרח. הסר את מלאי מעכבי ה-RNA פולימראז ו-RNase מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס והנח אותם על קרח. הפשירו את תבנית ה-DNA ב-RT והניחו על קרח.
   2. הכן תערובת מאסטר תגובה נטולת תאים לפי טבלה 2 על ידי הוספת כל רכיב בסדר הבא לצינור של 2 מ"ל על קרח: תערובת מאסטר של חומצות אמינו, תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה, Mg-גלוטמט, K-גלוטמט, תבנית DNA, PEG-8000, T7 RNA פולימראז ומעכב RNase. העבירו בעדינות את השפופרת לאחר כל הוספה לתערובת המאסטר.
      הערה: אם יש להשתמש בתבנית ליניארית לביטוי חלבון נטול תאים, הוסף פי 5-10 יותר חומר בהשוואה לתבנית הפלסמיד כדי להשיג תשואות ניכרות של חלבון.
   3. הסר את ליזאט התאים הגולמיים של V. natriegens מהמקפיאים של -80 מעלות צלזיוס והניח על קרח למשך 10-20 דקות עד להפשרה. הוסף את הנפח המתאים של תמצית תאים גולמיים לתערובת מאסטר התגובה נטולת התאים לפי טבלה 2 וערבב בעדינות על ידי החלקה או פיפטינג למעלה ולמטה.
   4. ביטוי חלבון נטול תאים בנקודת קצה באמצעות תרמרוציקלר
      1. פיפטה 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר התגובה נטולת התאים לתחתית צלחת PCR של 96 או 384 בארות. בין כל העברה לצלחת ה-PCR, מערבבים את תערובת המאסטר על ידי לחיצה עדינה על הצינור.
         הערה: יש לערבב היטב תערובת מאסטר תגובה נטולת תאים בכל עת כדי למקסם את שחזור התגובה וביטוי חלבון ללא תאים בכל הדגימות.
   5. צנטריפוגה קצרה של הצלחת ב-1,000 x גרם למשך 10 שניות כדי לאגור כל תערובת מאסטר שאולי נתקעה בצידי הבארות. אטמו את הבארות עם דבק צלחת למניעת אידוי, ולאחר מכן הנח את לוחית ה-PCR לתוך תרמרוציקלר המוגדר ל-26 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם המוגדר ל-105 מעלות צלזיוס.
      הערה: פיזור החום האחיד והמכסה המחומם של תרמו-סייקלר משפרים מאוד את תפוקת ביטוי החלבון.
   6. דגרו על התגובות נטולות התאים למשך 3 שעות לפחות. לאחר הדגירה, ניתן לטהר, לכמת ולהשתמש בחלבונים מבוטאים לתהליכים במורד הזרם.
      הערה: ניתן לכמת חלבונים מבוטאים ישירות בתגובה נטולת התאים בשיטה לבחירת המשתמש. לדוגמה, ניתן לכמת חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות עקומה סטנדרטית חיצונית, או למדוד רדיואקטיביות אם משתמשים בחומצת אמינו עם תווית רדיו בתגובה נטולת תאים. ספקטרוסקופיה גלויה ל-UV או מבחני חלבון כוללים בדרך כלל אינם מומלצים למדידה ישירה של ייצור חלבון בתגובות נטולות תאים ללא טיהור ראשוני.

טבלה 1: ריאגנטים להכנת 5 מ"ל של תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה פי 10 ו-2.4 מ"ל של תערובת מאסטר של חומצות אמינו פי 4.

הכנת מיקס מאסטר
רכיב	ריכוז מלאי (mM)	ריכוז סופי (מ"מ)	כמות (מיקרוליטר)	נפח סופי (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA מ-E. coli MRE 600 (מ"ג/מ"ל)*	100	2	100.00
קו-אנזים A הידראט	200	2.6	65.00
נאד	200	3.3	82.50
מחנה	650	7.5	57.69
חומצה פולינית	100	0.7	35.00
ספרמידין	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
מים סטריליים נטולי יונים			49.99
	הכנת 4x חומצות אמינו מאסטר מיקס
רכיב	ריכוז מלאי (mM)	ריכוז סופי (מ"מ)	כמות (מיקרוליטר)	נפח סופי (μL)
אילן אלכסנדר	168	8	114.3	2400
ארג	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ASP	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
גלי	168	8	114.3
שלו	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
ליס	168	8	114.3
פגשתי	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
מקצוען	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
ת'ר	168	8	114.3
ואל	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
טיר	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
ציס	168	8	114.3
מים סטריליים נטולי יונים			91.4

תמיסת אנרגיה 10x

טבלה 2: רכיבים של תערובת אב אופטימלית של תגובה נטולת תאים של V. natriegens עבור תבנית DNA

מיקס מאסטר תגובה נטול תאים
רכיב	ריכוז מלאי (mM)	ריכוז סופי (מ"מ)	כמות (מיקרוליטר) תגובה פי 1	כמות (מיקרוליטר) פי 50 תגובות
תמצית (%)		25	2.50	125.00
מ"ג-גלוטמט	100	3.5	0.35	17.50
K-גלוטמט	2000	80	0.40	20.00
4x תערובת מאסטר של חומצות אמינו	8.0	2	2.50	125.00
10x מיקס מאסטר פתרונות אנרגיה			1.00	50.00
DNA פלסמיד (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50% PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
T7 RNA פולימראז			1.00	50.00
מעכב RNase, עכבר			0.10	5.00
מים סטריליים נטולי יונים			1.25	62.50
נפח תגובה (μL):	10

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות 15 מ"ל	קורנינג	352196
צינורות 2 מ"ל	אפנדורף	22363352
לוחות בדיקה שחורים 384 בארות	קורנינג	3544
צלחות PCR עם 384 בארות	אפנדורף	951020702
צינורות 50 מ"ל	קורנינג	352070
צלחות PCR עם 96 בארות	אפנדורף	30129300
אדנוזין 3',5'-מונופוספט מחזורי נתרן מלח מונוהידראט	סיגמא	א6885
אדנוזין 5'-טריפוספט - 100 מ"מ	נב	N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler	תרמו-פישר	4388444
דבקי צלחת בדיקה	ביוראד	MSB1001
β-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד הידרט (NAD)	סיגמא/רוש	10127965001
קו-אנזים A הידרט	סיגמא	C4283
ציטידין 5'-טריפוספט - 100 מ"מ	נב	N0450L
D-(-)-3-חומצה פוספוגליצרית מלח דיסודיום (3-PGA)	סיגמא	עמ' 8877
בקבוק דיואר - 4 ליטר	תרמו-סיינטיפיק	10-194-100ג
תמיסת DL-Dithiothreitol - 1 מ '	סיגמא	42816
חומצה פולינית מלח סידן הידרט	סיגמא	47612
חומצה אצטית קרחונית	סיגמא	א6283
גואנוזין 5'-טריפוספט - 100 מ"מ	נב	N0450L
הפס	סיגמא	H3375
חומצה L-גלוטמית, מלח המימגנזיום טטרהידרט	סיגמא	49605
L-חומצה גלוטמית מלח אשלגן מונוהידראט	סיגמא	G1149
מגנזיום כלוריד (MgCl₂)	סיגמא	M8266
פלסמיד pJL1-sfGFP	אדג'ן	69496
ערכת פלסמיד פלוס מקסי	קיגן	12963
פולי (אתילן גליקול) (PEG)-8000	סיגמא	89510
אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא	עמ' 9333
כדורי אשלגן הידרוקסיד	סיגמא/רוש	1050121000
מעכב RNase, עכבר	נב	M0314
דגימת חומצות אמינו RTS	ארנב ביוטק	BR1401801
נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא	S7653
ספרמידין	סיגמא	S0266
T7 RNA פולימראז	נב	M0251
תמיסת טריס (pH 8.0) - 1 מ'	Invitrogen	AM9856
tRNA מ - E. coli MRE 600	סיגמא/רוש	10109541001
אורידין 5'-טריפוספט - 100 מ"מ	נב	N0450L
Vibrio natriegens (סוג פראי) ציר ליופילי	ATCC	14048