ניטור בזמן אמת של גדילת חיידקים באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרופלואידית

תקציר

מקור: Jian, X. et al., טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את השימוש בפלטפורמה מבוססת טיפות מיקרופלואידיות לניטור בזמן אמת של צמיחת חיידקים. על ידי יצירת טיפות אחידות המכילות תרחיפי חיידקים והנחיית אותם במסלול זיהוי, המערכת מאפשרת מדידה אופטית רציפה של צפיפות התאים לבניית עקומת גדילה.

פרוטוקול

1. הכנות

1. חבר את מחט המזרק (הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ), המחבר המהיר A ובקבוק הריאגנט (איור 1C), וחיטוי אותם ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   הערה: נתק מעט את מכסה בקבוק המגיב במהלך העיקור. ניתן להכין בכל פעם עוד כמה בקבוקי ריאגנטים לשימוש.
2. השתמש במסנן פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את שמן מערכת תרבית המיקרו-טיפות (MMC). הכניסו את השבב המיקרופלואידי (איור 1B) ושמן MMC לספסל הנקי מראש ועקרו אותם באמצעות הקרנה אולטרה-סגולה למשך 30 דקות לפני השימוש.
   הערה: לפרטים על מחבר מהיר A, בקבוק ריאגנט, שמן MMC ושבב מיקרופלואידי עיין בטבלת החומרים.
3. התקן את השבב המיקרופלואידי
   1. פתח את דלת תא ההפעלה (איור 1A) והרם את בדיקת הסיבים האופטיים.
   2. יישר את חורי השדה החשמלי עם מחטי השדה החשמלי והנח בעדינות את השבב על כן השבב. לאחר מכן הכנס את שני עמודי המיקום לתוך חורי המיקום והנח את בדיקת הסיבים האופטיים (איור 1D).
   3. חבר את המחבר המהיר A בשבב ליציאה המתאימה של ה-MMC בהתאם למספר המיקום (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). ואז סגור את דלת תא הניתוח.
4. מלאו את שמן ה-MMC (לכ-80 מ"ל) בבקבוק השמן ורוקנו את נוזל הפסולת בבקבוק הפסולת לפני השימוש.
   הערה: נוזל הפסולת הוא בדרך כלל פסולת אורגנית. אנא עיין בחוק ובתקנות האזוריים בעת הסילוק, בכפוף לשינויים בהתאם להגדרת הניסוי.

2. מדידת עקומת גדילה ב-MMC

1. הכנה לתמיסת החיידקים הראשונית
   1. פעל לפי התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת לוריא-ברטאני (LB) בינוני וחיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: רכיבים של מדיום LB: NaCl (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ליטר) וטריפטון (10 גרם/ליטר).
   2. הוציאו את הזן Escherichia coli (E. coli) MG1655 ממלאי הגליצרול וטפחו אותו בבקבוק שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום LB באינקובטור רועד (200 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 שעות.
      הערה: זמן הטיפוח תלוי בזנים הספציפיים. אופטימלי לטפח את הזן בתקופה/שלב הלוגריתמי.
   3. יש לדלל את תמיסת E. coli MG1655 המתורבתת במדיום טרי לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.05-0.1 לקבלת תמיסה חיידקית ראשונית (הכינו כ-10 מ"ל).
2. לחץ על אתחול כדי לאתחל את ה-MMC. לאחר הופעת ממשק האתחול, הגדר את טמפרטורת הגידול כ-37 מעלות צלזיוס ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ-0.6 (איור 2A). האתחול ייקח כ -20 דקות.
3. הפעל את האולטרה סגול (UV) lamp (אורך גל 254 ננומטר) במהלך האתחול.
4. הזרקו את תמיסת החיידקים הראשונית ושמן MMC לבקבוק המגיב.
   1. הוצא בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי והדק את המכסה.
   2. השתמש במזרק סטרילי של 10 מ"ל כדי להזריק 3-5 מ"ל שמן MMC ממחט המזרק של צינור הצד. הטה וסובב את בקבוק המגיב באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור במלואו לדופן הפנימית.
   3. הזרקו כ-5 מ"ל של תמיסת חיידקים ראשונית, ולאחר מכן מלאו את בקבוק המגיב על ידי הזרקת 5-7 מ"ל מהשמן שוב.
   4. משוך החוצה את המחבר המהיר העצמאי A והכנס את המחבר המהיר A של בקבוק הריאגנט לתוך המחבר המהיר B שלו כדי להשלים את פעולת הזרקת הדגימה (איור 3A).
5. המתן לסיום האתחול ולאחר מכן כבה את מנורת ה- UV (אורך גל 254 ננומטר).
6. פתח את דלת תא ההפעלה, והכניס את בקבוק המגיב לאמבט המתכת.
7. משוך החוצה את מחבר ה-C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. ואז סגור את דלת תא הניתוח.
8. לחץ על עקומת גדילה כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה (איור 2A). בממשק הגדרת הפרמטרים, הזן את המספר כ-15, הפעל את מתג זיהוי ה-OD והגדר את אורך הגל כ-600 ננומטר. לחץ על התחל כדי להתחיל ביצירת טיפות. זה ייקח בערך 10 דקות. הערה: כאן, Number מתייחס למספר הטיפות שיש ליצור. אורך גל מתייחס לאורך הגל של ה-OD שיש לזהות. הגדר את המספר (מקסימום 200) ואורך הגל (350-800 ננומטר) בהתאם לדרישות הניסוי.
9. כאשר מופיע חלון מוקפץ בממשק הראשי המבקש "הסר את בקבוק המגיב בין C2 ל-O2, ולאחר מכן לחץ על כפתור אישור לאחר השלמתו", פתח את דלת תא ההפעלה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו-O2.
10. סגור את הדלת ולחץ על כפתור אישור בחלון המוקפץ כדי לטפח אוטומטית את הטיפות ולזהות את ערכי ה-OD.
    הערה: ה-MMC מזהה את ערך ה-OD כאשר הטיפה עוברת את בדיקת הסיב האופטי. לכן, תקופת הזיהוי תלויה במספר הטיפות שנוצרו.
11. כאשר עקומת הגידול מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה-OD. בחר את נתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה-OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בפורמט .csv, אותו ניתן לפתוח על ידי תוכנה מתאימה (למשל, Microsoft Excel). לאחר מכן השתמש בתוכנת מיפוי (למשל, EXCEL ו-Origin 9.0) כדי לשרטט את עקומת הצמיחה.
    הערה: במהלך תהליך הטיפוח, ניתן ללחוץ על ייצוא הנתונים בכל עת כדי לייצא את נתוני ה-OD של כל הטיפות הנוכחיות.

תוצאות

איור 1: מבנה וכלים חיוניים של MMC. (א) תא חיצוני ותפעולי של MMC. (B) השבב המיקרופלואידי של MMC. לשבב שבעה ערוצים (C1-C6 ו-CF). (ג) בקבוק ריאגנט. יש לו צינור עליון וצינור צדדי. לפני הזרקת הדגימה לבקבוק המגיב, חבר תחילה מחט מזרק למחבר מהיר A, ולאחר מכן חבר ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 מיקרומטר קרום מסנן PVDF	מרק מיליפור בע"מ	SLGPR33RB	עקר את שמן MMC
מקרר 4 מעלות צלזיוס	האייר	BCD-289BSW	לאחסון ריאגנטים
אגר	בקטון, דיקינסון ושות'	214010	להכנת צלחת מוצקה
ספסל נקי	בייג'ינג דונגליאן הר ייצור מכשירים ושות', בע"מ	DL-CJ-INDII	לניתוח אספטי ועיקור UV
מחשב	לנובו	E450	התקנת תוכנה ובקרת MMC
אינקובטור בטמפרטורה קבועה	שנחאי qixin מכשיר מדעי ושות', בע"מ	ל.ר.ה 250	לגידול מיקרוביאלי באמצעות מדיום מוצק
איזון אלקטרוני	אוהאוס	AR 3130	לשקילת ריאגנטים
צינור EP	תרמו פישר	1.5 מ"ל	לאיסוף טיפות
צינור הקפאה	תרמו פישר	2.0 מ"ל	לשימור זנים
גליצרול	מגיב כללי	G66258A	לשימור זנים
סיר עיקור בקיטור בלחץ גבוה	סניו אלקטריק	MLS3020	לעיקור חיטוי
מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)	לו-יאנג TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	MMC-I	ביצוע קביעת עקומת גדילה ואבולוציה אדפטיבית. נא לעיין http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
שבב מיקרופלואידית	לו-יאנג TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	MMC-ALE-OD	לפעולות טיפות שונות. נא לעיין http://www.tmaxtree.com/en/
שמן MMC	לו-יאנג TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	MMC-M/S-OD	שלב השמן למיקרופלואידיקה טיפתית. נא לעיין http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	מגיב כללי	G81793J	רכיב של מדיום LB
צלחת פטרי	קורנינג קורפורייטד	90 מ"מ	להכנת מדיום מוצק
פיפטה	אפנדורף	2.5 מיקרוליטר, 10 מיקרוליטר, 100 מיקרוליטר, 1000 מיקרוליטר	לטיפול בנוזלים
מחבר מהיר A	לו-יאנג TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	—	לחיבור של כל מפרק. נא לעיין http://www.tmaxtree.com/en/
בקבוק מגיב	לו-יאנג TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	MMC-PCB	דגימה ואחסון של תמיסת חיידקים וריאגנטים. נא לעיין http://www.tmaxtree.com/en/
בקבוק לנער	יוניון-ביוטק	50 מ"ל	לגידול מיקרוביאלי
אינקובטור רועד	שנחאי Sukun תעשייתי ושות', בע"מ	סקיי-210 2B	לגידול המיקרוביאלי בבקבוק שייק
מזרק	ג'יאנגסו ג'יו הדרכה רפואית ושות', בע"מ	10 מ"ל	שואבים נוזל ומזריקים אותו לבקבוק המגיב
מחט מזרק	חנות לחומרי בניין OUBEL	22 גרם	הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ.
טריפטון	אוקסואיד בע"מ	LP0042	רכיב של מדיום LB
מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד	SANYO אולטרה-נמוך	MDF-U4086S	לשימור מתח (-80 מעלות צלזיוס)
ספקטרופוטומטר UV-Vis	חברת ג'נרל אלקטריק	Ultrospec 3100 פרו	למדידת ערכי OD
תמצית שמרים	אוקסואיד בע"מ	ליפ 0021	רכיב של מדיום LB