טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP בלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium

תקציר

מקור: וובר, נ ' ואח', טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור בהקפאה של הלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מתאר הליך לביצוע טרנספורמציה טבעית בציאנובקטריה חוטית באמצעות DNA פלסמיד להשגת ביטוי GFP יציב ועמידות לאנטיביוטיקה באמצעות רקומבינציה הומולוגית.

פרוטוקול

1. טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP

הערה: הטרנספורמציה מבוססת על וקטור פלסמיד המופץ ב-Escherichia coli (E. coli); pGEM-T או pUC19 עשויים לשמש כווקטורים של עמוד השדרה. דוגמאות לווקטורים לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (sfGFP) מתוארות בסעיף התוצאות המייצגות.

1. בצע את כל השלבים באמצעות חומר סטרילי בתנאי מעבדה סטריליים (ספסל נקי, כלי זכוכית סטריליים).
2. יש לחסן 2 x 50 מ"ל של מדיום נוזלי f/2 בשתי צלוחיות של 250 מ"ל עם 2 x 1 מ"ל של חוטי Phormidium lacuna (P. lacuna) מתרבית ריצה. לטפח באור לבן (50 מיקרומול ^{m-2 s-1}) תחת תסיסה (סיבוב אופקי, 50 סל"ד) למשך ~5 ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
3. הכן ~200 מיקרוגרם של ה-DNA של וקטור הטרנספורמציה באמצעות ערכת הכנה של מידי לפי הוראות היצרן.
4. הומוגניזציה של 100 מ"ל של תרחיף תאי P. lacuna (ראה טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות. מדוד OD ב-750 ננומטר (ערך רצוי = 0.35).
5. צנטריפוגה את תרחיף התא למשך 15 דקות בטמפרטורה של 6,000 × גרם. הסר את ה-supernatant והשהה את הגלולה ב-800 מיקרוליטר (נפח כולל כולל נוזל שיורי וחוטים) של הנוזל הנותר ומדיום f/2⁺ נוסף.
6. קח שמונה צלחות f/2⁺ בקטו-אגר (קוטר 10 ס"מ) המכילות 120 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. פיפטה 10 מיקרוגרם של DNA באמצע כל צלחת אגר. פיפטה מיד 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לאמצע כל צלחת אגר (על גבי ה-DNA).
7. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לעודפי הנוזלים להתאדות. סוגרים את הצלחת ומטפחים אותה באור לבן בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
8. מחלקים את החוטים של כל צלחת אגר עם לולאת חיסון על מספר צלחות f/2⁺ בקטו-אגר טריות המכילות 120 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. טפחו את הצלחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע במיקרוסקופ.
9. זהה חוטים חיים שעברו טרנספורמציה לאחר 7-28 ימים תחת המיקרוסקופ. חפשו חוטים ירוקים בריאים (איור 1) ששונים מחוטים אחרים. אם ניתן לזהות את החוטים הירוקים הללו, המשך לשלב הבא; אחרת, שמור את הצלחת למשך 7 ימים נוספים.
10. השתמש במלקחיים כדי להעביר את החוטים החיים המזוהים הללו ל-50 מ"ל של מדיום f/2⁺ נוזלי עם 250 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. לטפח באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר (סיבוב אופקי, 50 סל"ד). התבונן בצמיחה עד ארבעה שבועות.
11. העבירו את החוטים בחזרה למדיום אגר המכיל 250 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין והמתינו עד שהחוטים יגדלו. לאחר מספר ימים, העבירו חוטים בודדים לצלחת אגר טרייה עם ריכוז גבוה יותר של קנמיצין, למשל, 500 מיקרוגרם/מ"ל. שמור את הצלחת המקורית.
12. ודא שהחוטים מופצים בריכוז גבוה של קנמיצין בתרבית נוזלית או על אגר. הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה. הערה: P. lacuna שעבר טרנספורמציה גדל עד 10,000 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. מינים אחרים עשויים שלא לסבול ריכוזים כה גבוהים.
13. לביטוי GFP: התבונן בחוטים בודדים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של המטרה שנקבעה ב-40x או 63x. צלם תמונת שידור שדה בהיר ותמונת פלואורסצנטיות. השתמש בהגדרות הבאות עבור GFP: פס פס של 470 ננומטר לעירור, פס פס של 525 ננומטר לפליטה ומפצל קרן של 495 ננומטר, זמן חשיפה ראשוני של 500 אלפיות השנייה.
14. התאם את זמן החשיפה לאותות פלואורסצנטיים ברורים, הימנע מעוצמות רוויה. נסה להשתמש באותה הגדרה עבור כל הדגימות.
15. מכיוון שהחוטים מסוג הבר יציגו גם פלואורסצנטיות, צלם תמונות עם אותן הגדרות כמו לעיל עבור פלואורסצנטי רקע זה.הערה: המתח המבטא GFP חייב להיות בעל אות גבוה יותר; אחרת, זה לא מבטא GFP.
16. בהתבסס על זמני החשיפה ועוצמות הפיקסלים של תמונות הקרינה, חשב והשווה את תכולת ה-GFP של החוטים השונים.

תוצאות

איור 1. חוטי Phormidium lacuna 5 שבועות לאחר הטרנספורמציה. נעשה שימוש בווקטור הביטוי sfGFP pMH1; הברירה התרחשה במדיום f/2 עם קנמיצין של 120 מיקרוגרם/מ"ל. החוטים הירקרקים עמידים וחיים; ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקטו אגר	אוטונורוואלד	214010
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ApoTome	צייס
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axio Imager 2	צייס
קנמיצין	סיגמא-אולדריץ'	25389-94-0
מיקרוסקופ DM750	צייס
ערכת מיצוי פלסמיד להכנה של Midi ערכת NucleoBond Xtra Midi	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
מקור אור, צינור פלואורסצנטי L18W/954 אור יום	אוסראם		גידול ציאנובקטריה
מקור אור, פנל לד XL 6500K 140 וואט	בלום סטאר	לא ישים	גידול ציאנובקטריה
צלחות פטרי פוליסטירול, 100 מ"מ על 20 מ"מ	מרק	P5606-400EA
צלחות פטרי פוליסטירול, 60 מ"מ על 15 מ"מ	מרק	P5481-500EA
פיפטמן 100-1,000 מיקרוליטר	גילסון	מק"ט: FA10006M
פיפטמן 10-100 מיקרוליטר	גילסון	מק"ט: FA10004M
פיפטות פלסטיק 10 מ"ל, סטריליות	גריינר	607107
שייקר יונימקס 2010	היידולף אינסטרומנטס		לגידול
צינור פלסטיק, סטרילי, 50 מ"ל	גריינר	227261
מגרסה שקטה Ultraturrax M	היידולף אינסטרומנטס		הומוגנייזר
F/2+ בינוני נוזלי	f/2-בינוני, עם NaNO₃ ו-NaH₂PO₄ מוגברים פי 10 (0.88 מ"מ NaNO₃, 36 מיקרומטר NaH₂PO₄
F/2+-אגר	3% (w/v) בקטו אגר, מי ים מלאכותיים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמינים, 8.8 מ"מ NaNO₃, 0.36 מ"מ NaH₂PO₄