יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

תקציר

מקור: Lea-Smith, D. J., et al. יצירת מוטציות מסומנות וחסרות סמן במינים ציאנובקטריאליים מודלים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים שיטה ליצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה. הפרוטוקול מתחיל בתרבית ציאנובקטריה, ואחריו צנטריפוגה ושלבי שטיפה המשמרים את פני השטח. לאחר מכן מוצג פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה המוקף ברצפים הומולוגיים. במהלך הדגירה, הפלסמיד מופנם באמצעות פילי ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. בחירת אנטיביוטיקה וריסוק משמשים לבידוד וטיהור הזן המוטנטי.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבותית
   1. הכן בינוני כחול-ירוק 11 (מדיום BG11) על פי קסטנהולץ (1988).
      1. הכן פתרונות מלאי של 100x BG11, יסודות קורט ומלאי ברזל (טבלה 1).
      2. הכן תמיסות נפרדות של מלאי פוספט, מלאי נתרן פחמתי (Na₂CO₃), N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid (TES) מאגר, ונתרן ביקרבונט (NaHCO₃) (טבלה 1).
      3. חיטוי מלאי הפוספט וה-Na₂CO₃. חוצץ TES מעוקר מסנן ו- NaHCO₃ עם מסננים של 0.2 מיקרומטר.
      4. הכן BG11 על ידי שילוב של 976 מ"ל מים, 10 מ"ל של 100x BG11, 1 מ"ל של יסודות קורט ו-1 מ"ל של מלאי ברזל, וחיטוי התמיסה. לאחר שתמיסה זו התקררה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 1 מ"ל ציר פוספט, 1 מ"ל ציר Na₂CO₃ ו-10 מ"ל NaHCO₃.
      5. עבור מדיום מוצק BG11, הוסף 15 גרם אגר ו -700 מ"ל מים לבקבוק אחד. לבקבוק השני מוסיפים 3 גרם נתרן תיוסולפט (Na₂S₂O₃), 226 מ"ל מים, 10 מ"ל של 100x BG11, 1 מ"ל יסודות קורט ו -1 מ"ל ציר ברזל. חיטוי שני הפתרונות. לאחר שתמיסות אלו התקררו לטמפרטורת החדר, שלבו אותן והוסיפו 1 מ"ל ציר פוספט, 1 מ"ל ציר Na₂CO₃, 10 מ"ל מאגר TES ו-10 מ"ל NaHCO₃.
         הערה: תמיסות מוכנות בנפרד כדי למנוע משקעים של מלחים מסוימים.
2. לבחירה על סוכרוז, הכינו תמיסת סוכרוז של 50% (w/v). מסננים מעקרים את התמיסה עם מסננים של 0.2 מיקרומטר ומוסיפים ל-BG11 (100 מ"ל של 50% סוכרוז ל-900 מ"ל של BG11) כדי לייצר צלחות סוכרוז BG11/5%.
   הערה: אין להוסיף NaHCO₃ לצלחות אגר סוכרוז BG11/5%. הוסף Na₂CO₃ כרגיל.
3. לתרבית של Synechococcus, הוסף 10 מ"ל של 1 M 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), ו-1 מ"ל של ויטמין B12 (טבלה 1) ל-1 ליטר של מדיום BG11.
   הערה: טרנספורמציה של זנים המתורבתים במדיה BG11 הזמינה מסחרית היא פחות יעילה משמעותית מאשר במתכוני המדיה BG11 המתוארים כאן, ולכן היא אינה מומלצת.

טבלה 1: פתרונות ששימשו במחקר זה.

מתכוני פתרונות מלאי
כימי	כמות (גרם)
100x BG11 (לליטר)
ננו₃	149.6
MgSO₄·7H₂O	7.49
CaCl₂·2H₂O	3.6
חומצת לימון	0.6
הוסף 1.12 מ"ל 0.25 M Na₂EDTA, pH 8.0
0.25 מ' Na₂EDTA, pH 8.0 (ל-100 מ"ל)
Na₂EDTA	9.3
יסודות קורט (ל-100 מ"ל)
H₃BO₃	0.286
MnCl₂·4H₂O	0.181
ZnSO₄·7H₂O	0.022
Na₂MoO₄·2H₂O	0.039
CuSO₄·5H₂O	0.008
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.005
ציר ברזל (ל-100 מ"ל)
אמוניום ציטראט ברזל	1.11
ציר פוספט (ל-100 מ"ל)
K₂HPO₄	3.05
ציר Na2CO3 (ל-100 מ"ל)
Na₂CO₃	2
חוצץ TES, pH 8.2 (ל-100 מ"ל)
TES	22.9
מלאי NaHCO3 (ל-100 מ"ל)
NaHCO₃	8.4
HEPES, pH 8.2 (ל-500 מ"ל)
הפס	119.15
ויטמין B₁₂ (ל-50 מ"ל)
ציאנוקובלמין	0.02
מדיה Luria Bertani (ל-500 מ"ל)
מרק לוריא ברטאני	12.5
1 מ' MgCl₂ (ל-100 מ"ל)
MgCl₂·6H₂O	20.33
פתרון א' (ל-200 מ"ל)
MnCl₂·4H₂O	0.395
CaCl₂·2H₂O	1.47
2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית הידרט, 4-חומצה מורפולינאתנסולפונית (MES)	0.4265
תמיסה A + גליצרול
תמיסה של 10 מ"ל A
1.5 מ"ל גליצרול

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. צמיחה של זנים ציאנובקטריאליים

1. זני תרבית בצלוחיות חרוטיות של 100 מ"ל בנפח מרבי של 50 מ"ל ומנערים במהירות של 120 סיבובים לדקה (סל"ד). אטום את לוחות BG11 עם Parafilm ונקב שלושה חורים קטנים בצד הצלחת כדי לאפשר חילופי גזים. דגירה של כל הזנים ב-30 מעלות צלזיוס מתחת לנורות פלורסנט בפוטו-ביו-ריאקטור בעוצמת אור בין 20-40 מיקרומול פוטונים m-2 sec-1.
2. השתמש בטכניקות הסטריליות הטובות ביותר. טפל בכל זני הציאנובקטריאליים בקולט אדים למינארי.
   הערה: זה חשוב במיוחד כאשר זנים מתורבתים עם חומר המכיל סוכרוז, שיכול להיות מזוהם בקלות.

3. יצירת מבני פלסמיד

1. תכנן ערכות של פריימרים, כולל אתרי אנזימי ההגבלה הנדרשים, באמצעות תוכנת תכנון פריימר כגון Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), כדי להגביר שני אזורים של ~1 kb 5' ו-3' של הגן המבוקש. עיין ברצף הגנום של מיני הציאנובקטריאליים באמצעות Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). ראה טבלה 2 עבור כל הפריימרים המשמשים כאן. בעת תכנון פריימרים, שקול את הגורמים הבאים:
   1. ודא שאזורים מוגברים כוללים אזורים של 5' ו-3' של הגן שיעברו מוטציה, למשל. איור 1.
   2. אין לבצע מוטציות באזורים בין-גניים כדי למנוע מוטציה לא מכוונת של RNA אנטי-סנס ולא מקודד.
   3. בעת בחירת אזורי אגף, אל תכלול את כל מסגרת הקריאה הפתוחה של גנים סמוכים, מכיוון שביטוי גנים אלה ב-Escherichia coli עלול להפריע לשיבוט.
2. הגברת מוצרים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות DNA פולימראז בנאמנות גבוהה בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: מניסיוננו, אנזים זה מייצר מעט טעויות.
   1. הגדר תגובות PCR של 50 מיקרוליטר המכילות מאגר בנאמנות גבוהה (מאגר HF) ו-0, 1.5 או 3 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). השתמש ב-100 ננוגרם של DNA גנומי לכל תגובה. השתמש בתוכנית המורכבת משלב דנטורציה ראשוני של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 35 סיבובים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריו שלב הארכה סופי של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. זה בדרך כלל נותן מוצרים עקביים.
3. אמת מוצרי PCR ודגימות שעוכלו עם אנזימי אנדונוקלאז לגודל הנכון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. יש להריץ 1% (w/v) ג'ל אגרוז המכיל 0.02% (v/v) אתידיום ברומיד למשך 45 דקות ב-100 V.זהירות: אתידיום ברומיד הוא מוטגן פוטנציאלי ויש לטפל בו עם הגנה מתאימה.
4. יש לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור DNA בהתאם להוראות היצרן. כמו כן, השתמש בערכה זו לטיהור שברי פלסמיד, כולל חתיכות שנחתכו מג'ל אגרוז. לסלק DNA מטוהר ב-14 מיקרוליטר מים.
5. לשלבי שיבוט, דגרו תערובות תגובה אנדונוקלאז הגבלה ב-37 מעלות צלזיוס למשך > שעה בנפח כולל של 30 מיקרוליטר בהתאם להוראות היצרן.
6. לשלבי קשירה, קשרו שברי DNA בטמפרטורת החדר למשך > שעה בנפח כולל של 20 מיקרוליטר, המכילים 5 מיקרוליטר פלסמיד מעוכל מטוהר, 12 מיקרוליטר של תוספת מעוכלת מטוהרת, 2 מיקרוליטר מאגר ו-1 מיקרוליטר ליגאז.
7. הכן תאי טרנספורמציה Escherichia coli DH5α לפי השיטה הבאה.
   1. גדלו תרבית E. coli למשך הלילה ב-10 מ"ל של Luria Bertani (LB).
   2. יש לחסן 400 מ"ל LB בבקבוק חרוטי בנפח 1 ליטר המכיל 6 מ"ל 1 M MgCl₂ (טבלה 1) עם 1 מ"ל של תרבית לילה.
   3. גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד למשך כ-4 שעות או עד ש-OD₆₀₀nm מגיע ל-0.4-0.6.
   4. הניחו תאים על קרח למשך שעה.
   5. צנטריפוגה ב-2,800 × גרם למשך 10 דקות לתאי גלולה ב-4 מעלות צלזיוס.
   6. יש להסיר את הסופרנטנט ולהשרות מחדש בתמיסה A של 160 מ"ל (טבלה 1) ולדגור על קרח למשך 20 דקות.
   7. צנטריפוגה ב-2,800 × גרם למשך 10 דקות לתאי גלולה ב-4 מעלות צלזיוס.
   8. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-4 מ"ל תמיסה A + גליצרול (טבלה 1).
   9. מכינים 50 מיקרוליטר אליקוט, מקפיאים בנוזל N2, מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   10. מערבבים 5 מיקרוליטר תערובת קשירה עם 50 מיקרוליטר תאים מוכשרים ודוגרים למשך שעה על קרח.
   11. הלם חום של התאים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ולאחר מכן דגירה על קרח למשך 2 דקות.
   12. הוסף 950 מיקרוליטר של מדיה LB (טבלה 1) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   13. Aliquot 50 ו-200 מיקרוליטר על צלחות עם האנטיביוטיקה המתאימה, אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו/או קנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל).
       זהירות: גם קנמיצין וגם אמפיצילין רעילים ויש לטפל בהם בהגנה מתאימה.
   14. בחר ודגר מושבות בודדות במדיה של 2 מ"ל LB מחוסנת באנטיביוטיקה המתאימה.
8. טהר את כל הפלסמידים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד miniprep בהתאם להוראות היצרן.
9. צור פלסמידים, בדוגמה הספציפית הזו לדפיקת הגנים cpcC1C2 , על פי השלבים הבאים.
   1. הגדל את אזור האגף של 1,012 זוגות הבסיסים (bp) 5' (קטע שמאלי) באמצעות פריימרים cpcC1C2leftfor ו-cpcC1C2leftrev (ראה שלב 3.2, טבלה 2). הסר כמות קטנה מתגובת ה-PCR ואשר אם המוצר בגודל הנכון הוגבר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). עכל את הקטע הזה ואת pUC19 עם XbaI ו-BamHI (שלב 3.5).
   2. טהר את שני התכשירים (שלב 3.4), קשר (שלב 3.6), טרנספורמציה (שלב 3.7), והגדר ארבע תרביות נוזליות של 2 מ"ל LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ממושבות נפרדות לטיהור פלסמיד באמצעות מיני-הכנה (שלב 3.8).
   3. בדוק אם יש הכנסת השבר ל-pUC19 באמצעות עיכול XbaI/BamHI ואלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). רצועות של 2,660 bp ו-1,012 bp מצביעות על החדרה נכונה של התוסף לפלסמיד.
   4. הגביר את אזור האגף של 1,016 bp 3' (קטע ימני) באמצעות פריימרים cpcC1C2rightfor ו-cpcC1C2rightrev (ראה שלב 3.2, טבלה 2). הסר כמות קטנה מתגובת ה-PCR ואשר אם המוצר בגודל הנכון הוגבר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). עכל את השבר הזה ואת pUC19 עם SacI ו-EcoRI (שלב 3.5).
   5. טהר את שני התכשירים (שלב 3.4), קשר (שלב 3.6), טרנספורמציה (שלב 3.7), והגדר ארבע תרביות נוזליות של 2 מ"ל LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ממושבות נפרדות לטיהור פלסמיד באמצעות מיני-הכנה (שלב 3.8).
   6. בדוק אם יש החדרת השבר ל-pUC19 באמצעות עיכול SacI/EcoRI (שלב 3.5) ואלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). רצועות של 2,660 bp ו-1,016 bp מצביעות על החדרה נכונה של התוסף לפלסמיד. הערה: אתרי XbaI/BamHI לשיבוט אזור 5' ו-Sac I/EcoRI לשיבוט אזור 3' ל-pUC19 משמשים במידת האפשר. במידת האפשר, כלול תמיד אתר BamHI בפריימר האחורי עבור אזור 5' או את הפריימר קדימה עבור אזור 3' כדי להבטיח ששלבי שיבוט מאוחרים יותר יהיו קלים יותר לביצוע.
   7. רצף את שני התוספות כדי לקבוע אם הרצף נכון באמצעות פריימרים המשתרעים על פני אתר ההכנסה, למשל, M13 קדימה ו-M13 אחורה (טבלה 2). הרצף חייב להיות נכון כדי להבטיח שלא יוכנסו שגיאות לאזורי האגף.
   8. כרתו את השבר השמאלי מ-pUC19 באמצעות עיכול XbaI/BamHI. עכל את הקטע הימני pUC19 + עם XbaI/BamHI (שלב 3.5).
   9. טהר את השבר השמאלי של 1,012 bp ו-3,676 bp pUC19 + שבר ימני מג'ל אגרוז (שלב 3.3) באמצעות כריתת ה-DNA באמצעות להב אזמל.
   10. טהר את שני התכשירים (שלב 3.4), קשר (שלב 3.6), טרנספורמציה (שלב 3.7,) והגדר ארבע תרביות נוזליות של 2 מ"ל LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ממושבות נפרדות לטיהור פלסמיד באמצעות מיני-הכנה (שלב 3.8).
   11. בדוק אם יש הכנסת השבר לתוך pUC19 + שבר ימני באמצעות עיכול XbaI/BamHI (שלב 3.5) ואלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). רצועות של 3,676 bp ו-1,012 bp מצביעות על החדרה נכונה של התוסף לפלסמיד (התייחס לכך כפלסמיד B).
   12. הסר את קלטת הגן neomycin phosphotransferase/levansucrase (npt1/sacB) מ-pUM24cm19 באמצעות עיכול BamHI. עכל פלסמיד B עם BamHI (שלב 3.5).
       הערה: אין צורך לטהר את קלטת npt1/sacB מג'ל אגרוז מכיוון ש-pUM24cm מקודד חלבון המעניק עמידות לכלורמפניקול. לכן, אם מגדלים מושבות על לוחות אגר LB/אמפיצילין/קנמיצין, השילוב האפשרי היחיד שיוביל למושבות עמידות הוא שילוב קלטת npt1/sacB בפלסמיד B.
   13. טהר את שני התכשירים (שלב 3.4), קשר (שלב 3.6), טרנספורמציה (שלב 3.7), והגדר ארבע תרביות נוזליות של 2 מ"ל עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וקנאמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל) ממושבות נפרדות לטיהור פלסמיד באמצעות מיני-פרפים (שלב 3.8).
   14. בדוק אם יש הכנסת קלטת npt1/sacB לפלסמיד B באמצעות עיכול BamHI (שלב 3.5) ואלקטרופורזה של ג'ל (שלב 3.3). רצועות של 4,688 bp ו-3,894 bp מצביעות על החדרה נכונה של התוסף לפלסמיד (התייחס לכך כפלסמיד A).

טבלה 2: פריימרים ששימשו במחקר זה. אתרי אנדונוקלאז הגבלה מסומנים בקו תחתון.

תחל	רצף
cpcC1C2leftfor	GTACTCTAGAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev	GATCGGATCCGCGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2rightfor	GATCGAGCTCTGCACTGGTCAGTCGTTC
cpcC1C2rightrev	GACTGAATTCATCGTTGCTTGAACGGTCTC
M13 קדימה	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 הפוך	CAGGAAACAGCTATGAC
cpcC1C2עבור	GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev	ATGTCCCAGGAACGACTGAC
A1173עבור	AGCAAACCGTTTTTGTGACC
A1173rev	TGCAAGGTGGCGAACTGTAT

 

 

4. יצירת מוטציות סינכוציסטיס וסינכוקוקוס מסומנות

1. הגדר תרבית טרייה על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים לתוך 30-50 מ"ל של מדיום BG11. גדל את התרבית במשך 2-3 ימים לצפיפות אופטית של 750 ננומטר, או OD₇₅₀nm = 0.2 עד 0.6.
   הערה: בדרך כלל, מושבות בודדות קטנות מכדי להשתמש בהן לחיסון, וחשיפה של תאים בודדים אפילו לרמות אור נמוכות תגרום לעיכוב אור ובחירה עבור מוטציות עמידות לאור.
2. צנטריפוגה 1-2 מ"ל מהתרבית בחום של 2,300 × גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. אין לצנטריפוגה של תרביות ציאנובקטריאליות במשקל של >2,300 × גרם, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בתאים. שטפו את הגלולה פעם אחת עם מדיום BG11.
   הערה: אין להשעות תאים על ידי מערבולת, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן פילי, החיוני לספיגת DNA. השעו תאים על ידי פיפטינג עדין.
3. הוסף מדיום BG11 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. מעבירים תאים לצינור תחתון עגול של 14 מ"ל.
4. הוסף 1 מיקרוגרם פלסמיד A לתאים וערבב על ידי הקשה עדינה. הוסף <10 מיקרוליטר פלסמיד.
   הערה: רצוי שהפלסמיד יהיה בריכוז של >100 ננוגרם/מיקרוליטר, אך ריכוזים נמוכים מזה מספיקים לטרנספורמציה מוצלחת.
5. הניחו את הצינורות אופקית בחממה. דגירה על תרביות למשך 4-6 שעות.
   הערה: ניתן לערבב תאים לזמן קצר על ידי הקשה כל 1-2 שעות, אך זה לא חיוני. ניתן להניח דגימות בחממה רועדת, אם כי הדבר אינו משפר משמעותית את היעילות.
6. פזרו כמויות של תרבית התאים/תערובת ה-DNA של הפלסמיד על צלחות אגר BG11 ללא אנטיביוטיקה. בדרך כלל, 20 מיקרוליטר ו-80 מיקרוליטר נמרחים על צלחות נפרדות.
7. ~24 שעות לאחר מכן, הוסף 2.5-3 מ"ל של תמיסת אגר 0.6% במים המכילים קנמיצין (לכל 20 מ"ל: 0.12 גרם אגר, 100 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל קנמיצין) לצלחת האגר. מצננים את התמיסה הזו ל-~42 מעלות צלזיוס ומוסיפים אותה לקצה צלחת האגר. הטה את הצלחת כך שהתמיסה תיצור שכבת 'אגר עליון' אחידה על פני השטח.
8. דגרו על צלחות אגר לפרק זמן נוסף. המושבות צריכות להיות גלויות לאחר כ-7 ימים.
   הערה: ניתן לערום צלחות אגר בגובה 3 בחממה. בדרך כלל, מאות מושבות מתקבלות בכל טרנספורמציה.
9. פס מושבות בודדות על צלחות אגר BG11 + kanamycin (30 מיקרוגרם/מ"ל). חלקו את צלחת האגר ל-6 מגזרים והשתמשו בקיסם קהה כדי לפספס את המושבות מעל כל מגזר. השגת מושבות בודדות אינה חשובה; רק הצמיחה של הטרנספורמטורים היא.

תוצאות

איור 1: בניית פלסמיד ליצירת נוקאאוטים מסומנים ולא מסומנים, למשל, cpcC1 ו-cpcC2 ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ננו₃	סיגמא	S5506
MgSO₄·7H₂O	סיגמא	230391
CaCl₂	סיגמא	ג1016
חומצת לימון	סיגמא	ג0759
Na₂EDTA	פישר	EDT002
H₃BO₃	סיגמא	339067
MnCl₂·4H₂O	סיגמא	M3634
ZnSO₄·7H₂O	סיגמא	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	סיגמא	331058
CuSO₄·5H₂O	סיגמא	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	סיגמא	239267
אמוניום ציטראט ברזל	סיגמא	F5879
K₂HPO₄	סיגמא	עמ' 3786
Na₂CO₃	פישר	SODC001
TES	סיגמא	T1375
NaHCO₃	פישר	SODH001
הפס	סיגמא	H3375
ציאנוקובלמין	סיגמא	47869
Na₂S₂O₃	סיגמא	72049
בקטו אגר	ב.ד.	214010
סוכרוז	פישר	SUC001
צלחת פטרי 90 מ"מ משולשת אוורור	גריינר	633185
מסנני 0.2 מיקרומטר	סרטוריוס	16534
100 מ"ל צלוחיות חרוטיות	פיירקס	CON004
Parafilm M 100 מ"מ x 38 מ'	במיס	FIL003
פולימראז DNA בנאמנות גבוהה של Phusion	פוסיון	F-530
אגרוז	מלפורד	MB1200
ערכת טיהור DNA	מוביו	12100-300
אנדונוקלאזות הגבלה	נב
T4 ליגאז	תרמו סיינטיפיק	EL0011
מרק לוריא ברטאני	Invitrogen	12795-027
MES	סיגמא	M8250
קנמיצין סולפט	סיגמא	60615
אמפיצילין	סיגמא	א9518
ערכת מיני-הכנה של פלסמיד GeneJET	תרמו סיינטיפיק	K0503
שפופרת תחתונה עגולה 14 מ"ל	בז BD	352059
גליצרול	סיגמא	G5516
DMSO	סיגמא	D8418