יצירת פליקלים ננוצלולוזיים חיידקיים המוטמעים במגנטיט

תקציר

מקור: אריאס, ס. ל. ואחרים. ייצור ננוצלולוז חיידקי מגנטי פונקציונלי עם ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הסינתזה במקום של ננו-חלקיקי מגנטיט בתוך פליקל ננו-צלולוזי חיידקי המיוצר על ידי גלוקונאצטובקטר קסילינוס. הוא מסביר כיצד ננוצלולוז חיידקי מגנטי נוצר באמצעות הזרקת יוני ברזל, משקעים אלקליים וטיהור.

פרוטוקול

1. סינתזה של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מצופים פולימר והפקדה שלהם בממברנת ננוצלולוז חיידקית (BNC)

1. מבעבע 1,000 מ"ל מים טהורים בגז חנקן כדי להסיר חמצן מומס מהמים ולהחליפו בחנקן.
2. השתמשו בבקבוקון תלת-צוואר עגול-תחתית להכנת תמיסה ביחס מולרי של 2:1 של ברזל (III), כלוריד הקשהידרט (FeCl₃·6H₂O) וטטרהידרט ברזל (II) כלוריד (FeCl₂·4H₂O) מדולל במים נטולי חמצן וטוהרים גבוהים. לדוגמה, השתמש ב-5.4 גרם FeCl_{3.6H 2}O ו-1.98 גרם FeCl_{2.4H 2}O ב-10 מ"ל מים נטולי חמצן וטוהרים גבוהים. אם ההכנה הופכת לצמיגה מדי וקשה לערבוב, יש להשתמש ב-0.54 גרם FeCl_{3.6H 2}O ו-0.198 גרם FeCl_{2.4H 2}O ב-20 מ"ל מים נטולי חמצן וטוהרים גבוהים.
   הערה: הפחתת זמן החשיפה של FeCl₂·4H₂O לאוויר על ידי שקילת התרכובת הכימית הזו במהירות האפשרית. לאחר הכנסת הבקבוק התחתון העגול בעל שלושת הצוואר, סגור את הבקבוק התחתון העגול בעל שלושת הצווארים עם פקקי מחיצה עד שהוא מחובר לאספקת גז החנקן ולצינור המעבה.
3. השתמש בשני צווארי הכלי כדי לספק כניסה ופלט קבועים של גז החנקן על ידי חיבור אספקת גז החנקן למחט שמחוברת בפקק מחיצה ומקובעת לצוואר הכלי.
4. הניחו 1 פליקל BNC (קוטר 15.6 מ"מ ועובי 2-3 מ"מ) בכלי עם המגיבים. ודא שהדגימה טבולה לחלוטין בנוזל.
5. חבר את הצוואר הנותר של הכלי לצינור מעבה. בנוסף, השתמש בצינור ייבוש מלא בסולפט סידן חסר מים מעל צינור המעבה. להעביר מים דרך צינור הקונדנסר.
6. אטום את כל חיבורי הזכוכית עם גריז ואקום.
7. חממו את התמיסה באמבט שמן סיליקון לטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס באמצעות פלטת חימום מערבבת והחזיקו את הטמפרטורה עד שלב 1.10. השתמש במוט ערבוב מגנטי קטן כדי לערבב את המגיבים ב-350 סל"ד למשך 5 דקות. ודא שה-BNC מושרה כראוי בתמיסת הברזל ושהמגיבים מומסים לחלוטין. המשך לערבב את התערובת עד סוף הניסוי.
   הערה: השתמש במדחום כדי לבדוק את טמפרטורת שמן הסיליקון. הוא אמור להיות יציב ל-80 מעלות צלזיוס.
8. הגבר את מהירות הערבוב ל-700 סל"ד ומוסף (על ידי הורדה) בפרק זמן של 5 דקות 5 מ"ל הידרוקסיד אמוניום (NH₄OH, 14%) ל-10 מ"ל תמיסת ברזל באמצעות מחט פיפטינג, שגם היא נקבעה בפקק מחיצה. לאחר הוספת הידרוקסיד האמוניום, צבע התמיסה משתנה מצהוב/כתום לשחור.
9. המשיכו לערבב את התמיסה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עוד 5 דקות. הימנעו מערבובות מהירות גבוהה כדי לשמור על שלמות הדגימה. מהירויות גבוהות, כלומר מעל 1,000 סל"ד, יכולות להרוס את הדגימה.
10. הורידו את טמפרטורת התמיסה ל-30 מעלות צלזיוס באמצעות תחתית הפלטה המערבבת בבקרת הטמפרטורה והמשיכו לערבב עוד 5 דקות. אחר כך, כבה את הפלטה החממה. בשלב זה, ננו-חלקיקי תחמוצת הברזל (IONPs) שולבו ברשת BNC.
11. מקררים את התערובת לטמפרטורת החדר (RT) והפרדו את הננו-חלקיקים המגנטיים (MNPs) ואת BNC באמצעות מגנט קבוע חזק (למשל, 1 טסלה). לשם כך, העבר את התערובת לבקבוק כלי ואז, תוך שמירה על המגנט קרוב לכלי, מחזיקים את ה-MNPs וה-BNC במקום תוך כדי דקנט הסופרנטנט.
    הערה: היזהר כשאתה מפעיל מגנטים חזקים כי הם עלולים להזיק אם משתמשים בהם בצורה לא נכונה. לשלבים (1.12) - (1.14) ו-(1.16) השתמשו במים נטולי חמצן וטוהרים שהוכנו קודם ב-(1.1) כדי למנוע חמצון של חלקיקים.
12. החזירו את ה-MNPs וה-BNC למים של 100 מ"ל. נער בעדינות את התמיסה כדי להסיר את כל ה-MNPs שלא משולבים חזק ב-BNC. פנט שוב את הסופרנטנט על ידי החזקת ה-MNPs וה-BNC במקום באמצעות המגנט.
13. שטפו את ה-MNP ואת ה-BNC מספר פעמים במים עד שהסופרנטנט מגיע ל-pH ניטרלי (pH~7), כפי שנמדד באמצעות רצועת צבע.
14. הפרד את ה-BNC הפונקציונלי מגנטי או ננו-צלולוז חיידקי מגנטי (MBNC) מה-MNP באמצעות פינצטה ושוטף את ה-MBNC מספר פעמים במים עד שהמים יוצאים צלולים.
15. סטריליזציה של ה-MBNC על ידי חשיפת ה-O/N של MBNC ל-UV (110-280 ננומטר).
16. אוטוקלב של 500 מ"ל מים נטולי חמצן וטוהרים בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחסן את ה-MBNC ב-20 מ"ל מהמים הללו.
17. באופן אספטי, טבלו את הדגימה ב-1% פוליאתילן גליקול (PEG) וערבבו במשך שעתיים בטמפרטורה של RT (37 מעלות צלזיוס). הליך זה משפר את התאימות הביולוגית והיציבות של ננו-חלקיקי תחמוצת הברזל שהופקדו ב-BNC, במיוחד אלה שנחשפו על פני השטח. ציפוי ה-PEG יופץ על רשת MBNC התלת-ממדית.
    הערה: IONPs חשופים מתחמצנים בקלות באוויר בזכות פעילותם הכימית הגבוהה. למרות ש-PEG נחשב לחומר שאינו מתכלה, יציבותו הכימית תלויה בתנאים הביולוגיים המיושמים כגון תכולת מים, pH, טמפרטורה, נוכחות אנזימים, מיני חמצן פעילים, מיני חנקן תגובתיים ואחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גלוקואציטבקטר קסילינוס	ATCC	700178
הקסיהידרט כלוריד ברזל(III)	סיגמא אולדריץ'	236489-100G
הידרוקסיד אמוניום	מקרון פיין כימיקלים	6665-46
פולי (אתילן גליקול), ממוצע Mn 400	סיגמא אולדריץ'	202398-250G
טטרהידרט כלוריד ברזל (II)	סיגמא אולדריץ'	44939-250G
סולפט סידן חסר מים	ו.א. המונד דרירייט	13001
גריז בוואקום גבוה	סיגמא אולדריץ'	Z273554-1EA
רצועות בדיקת pH	סיגמא אולדריץ'	P4786-100EA
בקבוק זיקוק מסוג שלוש זוויות צוואר עם תחתית עגולה	סיגמא-אלדריץ'	CLS4965250
שמן סיליקון לאמבטיות שמן	סיגמא-אלדריץ'	85409-250ML
צינור ייבוש	כימגלאס	CG-1295-01
עוצר מחיצה, סוג שרוול	כימגלאס	CG-3022-98
מוט ערבוב מגנטי	כימגלאס	CG-2001-05
מעבה	כימגלאס	CG-1218-01
בקר טמפרטורה	בריסק היט	SDC120JC-A
ערבוב פלטת חימום	פישר סיינטיפיק	11-100-49SH