בדיקה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה לחקר אינטראקציות בין מיקרואורגניזמים לתולעים

תקציר

מקור: עלי, א., ואחרים. סקר בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים בדיקה פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה להערכת האופן שבו חיידקי המעיים משפיעים על עמידות ללחץ ב-Caenorhabditis elegans. על ידי מעקב אחר פלואורסצנציה כחולה מגרגרי מעי שנקרעו, הבדיקה חושפת אותות מוות מוקדמים יותר בתולעים שנחשפו לחיידקי בדיקה.

פרוטוקול

1. מערכת בדיקת הישרדות ללא תוויות Caenorhabditis elegans (C. elegans) (LFASS) הלם חום ובדיקות חמצון (ימים 13 - 14)

1. הערך את שלב ההתפתחות של התולעים. כאשר >90% מהתולעים הגיעו ל-L4, יש לאסוף את התולעים עד 10 מ"ל של תמיסת M9 סטרילית בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
2. שטפו את התולעים בהרחבה (לפחות פי 4) על ידי סיבוב בטמפרטורה של 142xגרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסרת הסופרנטנט, והוספת 10 מ"ל של M9 סטרילי טרי בין כל שטיפה כדי להיפטר מחיידקי Escherichia coli OP50. תלה מחדש את כדור התולעת ב-10 מ"ל של M9.
3. העבר 50 מיקרוליטר של תמיסת תולעת לצינור קישור נמוך המכיל 950 מיקרוליטר M9. לאחר ערבוב עדין של תכולת הצינור כדי למנוע שקיעת תולעים, יש להשתמש במהירות בקצה פיפטה רטוב עם חיבור נמוך כדי להעביר 3-4 טיפות נפרדות בנפח 10 מיקרוליטר לזכוכית או לפלטת גדילת נמטודה (NGM). לספור מספרי תולעים תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 16. ממוצע את הספירות מתוך 3-4 הטיפות וקבע את מספר התולעים למיקרוליטר בתמיסת התולעת.
4. כוון את ריכוז התולעים בצינור של 10 מ"ל כדי להגיע ל~120 תולעים ב-8 מיקרוליטר. אם הפתרון הוכן בשלב 1.2. לא מרוכז מספיק, מסובבים את התולעים למטה ומסירים את M9 בהתאם כדי להגיע ל-120 תולעים ל-8 מיקרוליטר.
5. העבר 8 מיקרוליטר של תמיסת תולעת (~120 תולעים) לכל אחד מהבארות של שמונת לוחות ה-NGM-אגרוז עם 96 בארות שהוכנו מראש, באמצעות פיפטה רב-ערוצית או פיפטה חוזרת. הקפידו להשתמש בקצוות עם שמירה נמוכה כדי להגביל את אובדן התולעים. ייתכן שיהיה צורך גם לחתוך את קצות הקצוות כדי לאפשר לתולעים בוגרות גדולות ולהגביל את הלחץ המכני על התולעים הבוגרות.
   הערה: הבדיקה דורשת מינימום של 30 תולעים חיות ובריאות כדי לפעול באופן אמין, אך היא עובדת הכי טוב עם כ-100 תולעים בכל באר.
6. דגרו את לוחות NGM-agarose עם זרעי תולעת וחיידקים עם 96 בארות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות.
7. בדוק את הלוחות בין 12 ל-24 שעות, וודא שהכדורים נשארים מלאים לאורך כל הזמן. אם יש צורך בהזנה מחדש, יש להחזיר את החיידקים ללוח מערך החיידקים של 96 בארות המאוחסן בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס, ולהוסיף עד 10 מיקרוליטר מהתמיסה החיידקית המתאימה לפלטות NGM-agarose של 96 בארות, שם התולעים בסיכון לרעב לפני תום תקופת הדגירה של 36 שעות (תולעים רעבות יניבו תוצאות שונות מאוד, אז זה מאוד חשוב).
   הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע ביום ה-15. לפני תחילת הבדיקה, ייתכן שיהיה צורך לאופטם את גובה הקריאה. הקריאה האופטימלית תושג בגובה 20-50 מיקרון מעל תחתית הבאר. זה תלוי בדגם של קורא הלוחות. חלקם מציעים אפשרות לסריקת Z, בעוד אחרים מאפשרים הזנת גובה ידנית. הגדר את הגובה האופטימלי ברמה שבה מזוהה אות הפלואורסצנציה הכחולה הגבוהה ביותר (365 ננומטר/430 ננומטר). חלק מקוראי הלוחות עשויים לפעול בגובה קבוע המותאם לבדיקות תא דבק, וייתכן שאינם אידיאליים לבדיקות LFASS.
8. לאחר 36 שעות, הזרקו 30 מיקרו-ליטר M9 לכל באר של לוח 96 בארות.
   הערה: לבדיקות לחץ תרמי, קורא הלוחות צריך להגיע לטמפרטורה הנדרשת לביצוע הבדיקה וייתכן שיהיה צורך להדליק אותו מראש. הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-42 מעלות צלזיוס כדי למקסם את מהירות ההריגה, אך הגישה חלה על טמפרטורות אחרות מעל 30 מעלות צלזיוס.
9. העבר תולעים (כ-20 מיקרוליטר) ללוח 384 בארות לפי הפריסה הקבועה, באמצעות קצוות עמידה נמוכה (שקול לחתוך את קצה הקצוות כדי לאפשר לתולעים גדולות להפחית את העומס המכני לתולעים בוגרות).
   הערה: למחקר הנוכחי, נעשה שימוש בשתי הגדרות קורא לוחות שונות לשתי הבדיקות המתוארות כאן (מתח תרמי ומתח חמצוני), ולכן הדגימות המיועדות לשתי הבדיקות הללו אינן צריכות להיות מצופות באותו לוח עם 384 בארות.
10. ודא שקוראי הלוחות מוגדרים כראוי (טבלה 1).
11. השלמו את לוחות ה-384 בארות עם יותר M9, במטרה לנפח סופי של 60 מיקרוליטר לבאר. לבדיקת מאמץ תרמי, הוסף 40 מיקרוליטר של M9, ועבור מאמץ חמצוני מושרה על ידי טרט-בוטיל הידרופרוקסיד (t-BHP), הוסף 34 מיקרוליטר של M9 ב-6 מיקרוליטר של t-BHP.
    1. התחל את הבדיקה תוך 2 דקות מהוספת t-BHP (באופן אידיאלי, כל התולעים חייבות להיות חשופות ל-t-BHP בו-זמנית, כאשר זמן הבדיקה הוא 2 דקות). אם לא אפשרי, השתמש בטיימר כדי להעריך את הזמן שהוקדש לפיפטינג של t-BHP לפני תחילת הבדיקה, כדי לאפשר התאמה מאוחרת יותר של זמן המוות החציוני.
12. סגור את הלוחות עם המכסה השקוף שלהן. אטום את קצוות לוחות ה-384 בארות עם סרט מסיכה (דבק על הלוח והמכסה), כדי לוודא שהסרט לא עובר על המכסה או מתחת לפלטה. חתך את הסרט בין המכסה ללוח במרווחים באמצעות סכין כדי לאפשר חילופי אוויר תוך מזעור אידוי במהלך הבדיקה.
13. הכנס את הפלטה לקורא הלוחות והתחל את הריצה. כוון לעורר ב-365 ננומטר ולזהות פליטה ב-435 ננומטר כל 2 דקות למשך 6-12 שעות (טבלה 1).
    הערה: בדרך כלל, 6 שעות מספיקות לבדיקות לחץ חום של 42°C ו-8 שעות לבדיקות עומס חמצוני ב-7% t-BHP.

טבלה 1: הגדרות לבדיקות חמצון ולחץ חום. דוגמאות להגדרות המשמשות לבדיקות מאמץ חמצוני (A) וחום (B) על קוראי לוחות פלואורסצנציה ששימשו במחקר זה.

חומרים