חילוץ חיידקים אפופלסטיים באמצעות שיטת לחץ מבוססת מזרקים

תקציר

מקור: Rufián, J. S. ואחרים, ניתוח תא יחיד של ביטוי גנים של Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים שיטת לחץ מבוססת מזרק להפקת חיידקים אפופלסטיים, המתרבים ויוצרים מיקרוקולוניות בתוך אפופלסט, המרחב הבין-תאי בין תאי הצמח. השיטה מניבה דגימות חיידקים נטולות פסולת, המתאימות לניתוח תא יחיד במורד הזרם.

פרוטוקול

הפקת חיידקים מהאפופלסט

1. ארבעה ימים לאחר החיסון, חתכו או את החלק האווירי של צמח ה-Arabidopsis או את העלה המחוסן מצמח השעועית והניחו אותו במזרק של 20 מ"ל ללא מחט (איור 2G). לגבי עלי השעועית, גלגלו את העלה על עצמו, והשאירו את הפנים האבקסיות החוצה, כפי שמוצג באיור 2F.
2. הוסיפו מספיק מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה (בדרך כלל 10-15 מ"ל).
3. הכנס את הבוכנה, וכאשר המזרק במצב אנכי כשהקצה פונה כלפי מעלה, הסר את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי טפיחה עדינה על הקנה עד שכל האוויר ממוקם קרוב לקצה. הזז את הבוכנה כדי להוציא את האוויר. לאחר שיש כמה שפחות אוויר בתוך המזרק, כסו את קצה קנה המזרק בשכבת פרפין.
4. לחצו בזהירות על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד שהרקמה הופכת כהה יותר (איור 1I ואיור 2H). לאחר מכן, משוך את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי (איור 1J ואיור 2I). חזור על השלב הזה 3-5 פעמים.
5. הסר את שכבת הפרפין ואת הבוכנה ואספו את הנוזל המכיל את החיידקים שהופקו מאפופלסט, כפי שמופיע באיור 2J.

תוצאות

איור 1: חיסון חיידקים והפקת אפופלסט באמצעות צמחי ארבידופסיס. (א) הכנת העציץ כאשר רשת המתכת מחוברת כראוי. (ב) זריעת זרעים באמצעות קיסם כדי להפיץ אותם כפי שמצוין

חומרים