טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

תקציר

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).

הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

פרוטוקול

1. טיהור RTA המסומן שלו באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

1. תאי סוניקט על קרח באמצעות הפרוטוקול הבא: פולס 15 שניות (20 מיקרון), הפסקה של 30 שניות. חזור על השלב הזה חמש פעמים.
2. ליזאט של תא צנטריפוגה בטמפרטורה של 21,000 x g ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומסנן סופרנטנט באמצעות מערכת סינון מזרק סטרילית (גודל נקבוביות 0.2 מיקרון).
   הערה: כדורי תאים של דגימות סוניקיות מוצלחות מראים גבולות שקופים.
3. השתמשו במערכת טיהור אוטומטית המצוידת בעמוד זיקה מבוסס Ni²⁺ בנפח 5 מ"ל כדי לטהר את שבר ה-RTA המסומן ב-His, מהסופרנטנט הסטרילי של E. coli . באופן כללי, יש להשתמש במהירות שחרור של 1 מ"ל לדקה ולקרר את כל מערכת הטיהור כדי למנוע קשירת רעלים לא יעילה ואובדן פעילות רעלנים.
   הערה: פרמטרים לטיהור יעיל של RTA מפורטים בטבלה 1.
   1. בקצרה, איזון את עמודת הזיקה עם 20 מ"ל של בופר קישור כדי להסיר את מאגר האחסון. מרח סופרנטנט מסונן סטרילי על עמודת הזיקה באמצעות מזרק.
   2. שטוף את העמודה עם 25-35 מ"ל של בופר קישור כדי להסיר את החלבונים הלא קשורים מהעמודה. בצע את שלב השטיפה עד שספיגת ה-UV ב-280 ננומטר מתקרבת לערך ההתחלתי של ה-UV.
   3. שבר RTA קשור לאלוט ב-20-35 מ"ל של בופר שחרור (500 mM אימידזול, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7.2) ושומרים על הדגימה על קרח (איור 1A ואיור 1B).
      הערה: שחרור שבר RTA מסומן בעלייה בספיגת UV. יש לשים לב לאסוף בלעדית את החלק הזה כדי למנוע זיהום בחלבונים קשורים לא ספציפיים.

טבלה 1: פרמטרים המשמשים לטיהור אפיניטי מבוסס עמודות והסרת מלח. רשימת כל הגדרות העמודה הרלוונטיות (למשל, קצב זרימה, ריכוז בופר שחרור, שיווי משקל ומשך שלב השטיפה) ופרמטרים שנמדדו (למשל, מוליכות או ספיגת UV).

פרמטר כרומטוגרפיית זיקה
פרמטרי מדידה	UV (280 ננומטר), ריכוז בופר Elution, מוליכות
הגדרות	משתנה/יחידה	ערך
קצב זרימה	mL/min	1
לחץ עמודה מקסימלי	MPa	0.35
אורך גל	ננומטר	280 ננומטר
בופר קישור	מיקום המשאבה	A
בופר השטפה	מיקום המשאבה	B
בופר שחרור ריכוז התחלתי	%	0
פיצוי נפח מערכת	מ"ל	10
איזון עמודות	מ"ל	20
הזרקת דגימה דרך סופרלופ/מזרק	מ"ל	נפח ליזאט התא
שלב הכביסה	מ"ל	20-35
שלב ההסרה	מ"ל	20-35
בופר שחרור ריכוז בזמן שחרור	%	100
כיול מחדש של עמודה עם 20% EtOH	מ"ל	50
פרמטר הסרת מלח
פרמטרי מדידה	UV (280 ננומטר), מוליכות
הגדרות	משתנה/יחידה	ערך
קצב זרימה	mL/min	4
לחץ עמודה מקסימלי	MPa	0.35
אורך גל	ננומטר	280 ננומטר
בופר קישור	מיקום המשאבה	A
בופר השטפה	מיקום המשאבה	B
בופר שחרור ריכוז התחלתי	%	0
פיצוי נפח מערכת	מ"ל	10
איזון עמודות	מ"ל	20
הזרקת דגימה דרך סופרלופ/מזרק	מ"ל	נפח ליזאט התא
הזרקת בופר להסרת מלח (0.8 מטר סורביטול)	מ"ל	100
כיול מחדש של עמודה עם 20% EtOH	מ"ל	50

תוצאות

איור 1: תוצאות הכרומטוגרפיה והפחתת זיקה מייצגת של תאי E. coli המכילים pET-RTA_(His)6 או בקרת וקטור ריק. (A) גרף טיהור טיפוסי של דגימת ליזאט של תא E. coli המבטא את RTA_(His)6

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספקטרופוטומטר Ultrospec 2100 pro	אמרשם
סוניפרפ 150	MSE		דגם ישן, דגמים אחרים זמינים
עליית פלואורוסקן	תרמו-סיינטיפיק	5210470	דגם ישן, לא זמין יותר
ÄKTAPurifier	תרמו-סיינטיפיק	28406266	המוצר הופסק ומוחלף
עמודת HP של HisTRAP	GE Healthcare	17-5248-02
עמודת הסרת המלחים של HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
מסנן סטרילי מידיסארט	סארטוריוס	16534K	גודל נקבוביות 0.2 מיקרון
ערכת בדיקת חלבון BCA	פירס	23225
ערכת בדיקה 660 ננומטר	תרמו-סיינטיפיק	22660
96 לוחות באר	תרמו-סיינטיפיק	260860