הסרטון הזה מדגים את ייצור הננוצלולוז על ידי גידול חיידקים המייצרים תאית במדיום מזין המכיל מניטול. החיידקים מטבוליזם מניטול לגלוקוז, אשר עובר פולימר ומופרז כשרשראות גלוקן שמתגבשות ליריעות תאית ויוצרות מטריצה תלת-ממדית בממשק האוויר-נוזל. הכדורים הג'לטיניים שנוצרים נאספים, מטוהרים בשטיפות אלקליות ומים, ומעוטרים באמצעות אוטוקלבינג ליישומים נוספים.
מאמר שיטה
הכנת פלטות ננו-צלולוזה חיידקיות מחיידקים מייצרי תאית
28 בנובמבר 2025
נפתח בלשונית חדשה
במאמר זה
תקציר
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת ננוצלולוז חיידקי (BNC)
הערה: כל השלבים מתבצעים בתנאים אספטיים, אלא אם צוין אחרת.
- תכין את המדיום התרבותי.
- הכינו 500 מ"ל מדיום תרבית נוזלי על ידי שילוב של 25 גרם תמצית שמרים, 15 גרם פפטון, 125.0 גרם מניטול ו-500 מ"ל מים טוהורים גבוהים. אוטוקלב התערובת הזו ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
- הכינו 100 מ"ל מדיום חצי-מוצק על ידי הוספת 15 גרם אגר ל-5.0 גרם תמצית שמרים, 3.0 גרם פפטון, 25.0 גרם מניטול ו-100 מ"ל מים טוהרים. אוטוקלב את התערובת הזו ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר האוטוקלב, יש להניח 5 מ"ל מהתערובת בצלחת פטרי פלסטית בגודל 90 מ"מ על 16 מ"מ. אפשר לתמיסה להתגשם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולשמור בטמפרטורה זו עד לשימוש נוסף.
- החזר את זן גלוקואסטובקטר קסילינוס (G. xylinus) המשומר בבקבוקונים מיובשים בהקפאה על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום תרבית נוזלי ופיפיפטינג למעלה ולמטה, כפי שמצוין בהוראות היצרן.
- החסן את צלחות פטרי המכילות מדיה חצי-מוצקה בטיפות קטנות של תלייה חיידקית באמצעות לולאת חיסון. ודאו שהאינקולום מכסה את כל צלחת הפטרי על ידי הזזת הלולאה בכיוון זיגזג מהקצה למרכז המנה.
- דגרו את צלחות פטרי בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות באינקובטור ללא CO2. לאחר סיום תקופת הדגירה, נראות מושבות לבנות קטנות. אם המושבות אינן מנוצלות מיד, יש לאחסן את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על ידי איטום המכסה בפראפילם והנחת הכלים הפוכים. ניתן לאחסן את המושבות כך עד 6 חודשים.
- העבר 2 מ"ל מדיום התרבית הנוזלית לכל באר של צלחת תרבית רקמה עם 24 בארות. קחו שתי מושבות עם מחט חיסון מהקערות פטרי המחוסנות והניחו אותן בבאר הראשונה של צלחת תרבית הרקמה. חזור על אותו הליך עבור 23 הבארות הנותרות.
- דגרו את צלחת תרבית הרקמה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. זה יניב סך של 24 פליקלים BNC בקוטר 16 מ"מ ועובי של כ-2-3 מ"מ, כפי שמוצג באיור 1. הערה: אל תפריע לתרבות החיידקים בשום שלב במהלך תקופת הדגירה, למשל על ידי ניעור הצלחות. במהלך תקופת הדגירה, G. xylinus פולט מולקולות סוכר גלוקיפיראנוז ליצירת רשת גבישית פולימרית בממשק האוויר-נוזל, אשר מאמצת את צורת וגודל הבקבוק בתנאי גידול סטטיים. מטריצה פולימרית זו, הידועה כננוצלולוז חיידקי (BNC), בולטת בסוף תקופת הדגירה.
- אוספים את הגלילים של BNC ממדיום הגידול ומעטאים אותם ב-200 מ"ל של תמיסת 1% NaOH למשך שעה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, כדי להסיר את כל שאריות G. xylinus. באופן אופציונלי, מערבבים את התמיסה ב-300 סל"ד באמצעות מוט מגנטי וצלחת ערבוב. השליכו את תמיסת ה-NaOH והוסיפו 200 מ"ל של תמיסת NaOH 1% טרייה. חוזרים על אותו תהליך פעם נוספת או עד שהפליקלים של BNC בתמיסה יקבלו מראה שקוף.
- שטפו את כדורי ה-BNC במים שלוש פעמים ואחסנו אותם במים טוהרים ב-RT. ודאו שהפליקלים של ה-BNC שקועים לחלוטין במים ולא נותנים להם להתייבש בכל עת.
- אוטוקלאב את הפליקלים של BNC בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: מחקר תת-עורי in vivo בעכברוש שבוצע על ידי מרטסון ועמיתיו לא הראה סימני התדרדרות של ה-BNC לאחר 60 שבועות של השרשה. למעשה, BNC מתפרק בטבעו על ידי אנזימים מיקרוביאליים ופטרייתיים, שאינם קיימים ביונקים. מצד שני, הביודגרבליות של ה-BNC יכולה להיות תוצאה של תהליכים מכניים, כימיים וביולוגיים שמחלישים את רשת המיקרופיבריל ב-vivo.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
איור 1. היבטים מקרוסקופיים של ננו-תאית חיידקית. כדורי BNC התקבלו לאחר תקופת דגירה של 11 ימים, שהיא בערך. 3 מ"מ בעובי. תקופת הדגירה תלויה בדרישות לשימוש המיועד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
שם חברה מספר קטלוג הערות גלוקואציטבקטר קסילינוס ATCC 700178 אגר סיגמא אולדריץ' A1296-500G D-Mannitol Bioxtra סיגמא אולדריץ' M9546-250G תמצית שמרים BD ביוסיינסס 212750 פפטון בקטריולוגי סיגמא אולדריץ' P0556 נתרן הידרוקסיד, תמיסה של 50% במים סיגמא אולדריץ' 158127-100G
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה