בידוד אנדוספורות מדגימה סביבתית באמצעות ניתוק ממוקד של תאים וגטטיביים

תקציר

מקור: וונדרלין, ט. ואחרים. בידוד פיזי של אנדוספורות מדגימות סביבתיות באמצעות פירוק ממוקד של תאים צמחיים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים שיטה לבידוד אנדוספורים מדגימה סביבתית המכילה גם תאים וגטטיביים וגם חיידקים שונים. ההליך כולל סינון, שיבוש מכני וטיפול כימי סלקטיבי להחלשת ופירוק תאים וגטטיביים תוך שמירה על האנדוספוגרים. השלב האחרון מבודד את האנדוספורות העמידות באמצעות סינון ממברנה.

פרוטוקול

1. הכנת כימיקלים וציוד

1. להכין 500 מ"ל של תמיסה של 1% נתרן הקסממטפוספט (SHMP) (NaPO₃)_n ועיקור באמצעות אוטוקלב.

2. סטריליזציה של מסנני ניטרוצלולוזה (NC) (גודל נקבוביות 0.22 מיקרון, קוטר 47 מ"מ) על ידי אוטוקלאב בצלחות פטרי מזכוכית סגורות.

3. סטריליזציה של מסנני NC (גודל נקבוביות 0.22 מיקרון, קוטר 25 מ"מ) על ידי אוטוקלבינג בצלחות פטרי מזכוכית סגורות.

4. שקלו ושימו לב למשקל הריק של צינורות סטריליים בנפח 50 מ"ל (עם מכסה) (שפופרת אחת לכל דגימה).

5. הכינו בופר טריס-EDTA (בופר TE) פעם: הכינו תמיסה של 10 מ"מ טריס (טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן) ו-1 מ"מ EDTA בופר. כוון את ה-pH ל-8 וסטריליזציה על ידי אוטוקלב.

6. הכינו תמיסת ליזוזים (20 מ"ג/מ"ל) על ידי המסה של 0.02 גרם ליזוזים ב-1 מ"ל TE-buffer. באופן אידיאלי, תעשה את זה טרי בכל פעם. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע.

7. הכינו תמיסה פיזיולוגית על ידי המסה של 8 גרם לליטר נתרן כלוריד (NaCl) במים מזוקקים. לחטא על ידי אוטוקלב.

2. הפרדת ביומסה מהמשקעים

1. הוסף 3 גרם דגימת משקע לצינורות סטריליים של 50 מ"ל שנשקלו מראש באמצעות כפות מתכת בוערות אתנול. בצע זאת בארון ביו-בטיחותי נקי, מחוקר ב-UV כדי למנוע זיהום.

2. להוסיף 15 מ"ל של תמיסת SHMP סטרילית 1% (אוטוקלב) לדגימה באמצעות בורט סטרילי מדורג ומדורג. ניתן גם לסנן את תמיסת SHMP כדי למנוע זיהום.

3. הומוגניזציה של המשקעים ותמיסת SHMP עם מפזר/הומוגניזר נוזלי (למשל, הומוגניזר Ultra-Turrax). 70% אתנול מעטא או אוטוקלאב של רוטור הפיזור לפני השימוש. הריץ את ההומוגניזציה למשך דקה אחת ב-17,500 סל"ד. תנו לדגימה לנוח 2 דקות וחזרו על ההומוגניזציה למשך דקה אחת באותה מהירות רוטור.

4. תן לדגימה לעמוד 10 דקות. בשלב זה, החלקיקים הכבדים ביותר (מינרלים) ישקעו. התאים וכל רכיב אורגני בדגימה, לעומת זאת, יישארו בתמיסה. לאחר מכן, מעבירים את תמיסת הסופרנטנט (המכילה ביומסה תאית) לצינור נקי בנפח 50 מ"ל, תוך שמירה על לא להפריע לכדור המשקע.

5. לכדור המשקע, מוסיפים שוב 15 מ"ל של תמיסת SHMP סטרילית של 1% (אוטוקלב) באמצעות בורט סטרילי מדורג ומדורג. לאחר מכן חזרו על שלבים 2.3 ו-2.4. חזרה זו מבטיחה את הפרדת הכמות המרבית של תאים וחלקיקים אורגניים מהרכיב המינרלי של המשקע. הסופרנטנט של ההפרדה השנייה הזו יכול להיות משולב עם הסופרנטנט מההפרדה הראשונה.

הערה: השלבים הבאים מתבצעים כולם על הסופרנטנט (המכיל ביומסה של תא). הרכיב המינרלי (פלט המשקעים) ניתן להשלך.

6. צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 20 x g למשך דקה. שלב זה מגדיל את כוח ה-G מספיק כדי ליישב חלקיקי מינרלים קטנים בעוד חומר התא הביולוגי נשאר בתמיסה. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את תמיסת הסופרנטנט (המכילה ביומסה תאית) לצינור נקי בנפח 50 מ"ל. זרוק את הכדור המינרלי.

7. קביעת הנפח הסופי של התמיסה המכילה ביומסה על ידי שקילת הדגימה. קביעת המשקל מונעת העברת הדגימה לצילינדר מדורג ומפחיתה את הסיכון לזיהום.

3. איסוף ביומסה על ממברנת סינון

1. הכינו יחידת סינון (לממברנות בקוטר 47 מ"מ) ומשאבת ואקום. סטריליזציה של יחידת הסינון או על ידי אוטוקלאב או (אם זכוכית פיירקס) על ידי ריסוס של 70% אתנול והשרתה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר לפני שממשיכים בפרוטוקול.

2. להוסיף ממברנת NC סטרילית ליחידת הסינון באמצעות מלקחיים סטריליים עם להבה באתנול.

3. להוסיף חצי מדגימת הסופרנטנט (מהשלב 2.6) ליחידת הסינון של הממברנה ולאסוף תאים על הממברנה באמצעות משאבת הוואקום.

4. כאשר הנוזל עבר במלואו דרך המסנן, עצור את משאבת הוואקום והסר בזהירות את הממברנה באמצעות מלקחיים מחוטאים בלבת אתנול. הנח את הממברנה בצלחת פטרי סטרילית.

1. חותכים את הממברנה לשניים באמצעות מספריים סטריליים עם להבה באתנול. הוסף כל חצי ממברנה לצינור נפרד של 2 מ"ל. חצי מהממברנה ישמש לחילוץ DNA וניתוח של כל קהילת החיידקים. החצי השני של המסנן יאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וישמש כגיבוי.

5. מניחים ממברנת NC חדשה על יחידת הסינון ואספו ביומסה מהחצי השני של נפח הדגימה (מהשלב 2.6) באמצעות משאבת הוואקום.

6. כאשר הנוזל עבר במלואו דרך המסנן, עצור את משאבת הוואקום והסר בזהירות את הממברנה באמצעות מלקחיים מחוטאים ומובהבים באתנול. שים את כל הממברנה בצינור נפרד של 2 מ"ל. דגימה זו תשמש לטיפול להפרדת האנדוספורות מהתאים הוגטיביים. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לשימוש.

4. פירוק תאים וגטטיביים

1. לבצע את הטיפול להפרדת האנדוספורות מתאים צמחיים על הביומסה שנאספה קודם לכן על ממברנת NC (שלב 3.6).

1. אם הממברנה הייתה קפואה, השאירו אותה ב-RT למשך 10 דקות להפשרה. לאחר מכן, מניחים את הממברנה בצלחת פטרי סטרילית וחתכו אותה (בערך 4 פעמים) לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים סטריליים עם להבה באתנול. לאחר מכן, שים את כל חלקי המסנן של הממברנה בתוך צינור סטרילי של 2 מ"ל.

2. הוסף 900 מיקרוליטר של בופר 1x TE (Tris-EDTA) (ראה 1.5) לצינור המכיל את ממברנת הדגימה וערבב היטב באמצעות מערבולת. בשלב זה, הביומסה מוסרת מהממברנה אל תמיסת TE-buffer.

3. מניחים את הצינור באינקובטור בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות ו-80 סל"ד. לאחר מכן, הוציאו את הצינור מהאינקובטור ותנו לו להתקרר במשך 15 דקות.

4. מוסיפים 100 מיקרול ליזוזים טרי (ראו 1.5) כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. אל תוסיפו את הליזוזים לפני שהדגימה התקררה ל-37 מעלות צלזיוס, שכן זה עלול לפרק את האנזים.

5. דגירה של הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ו-80 סל"ד, התנאים האופטימליים לליזוזים לליז תאים צמחיים.

6. לאחר סיום הפירוק, מוסיפים לדגימה 250 מיקרוליטר של 3 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) ו-250 מיקרוליטר של 6% תמיסת נתרן דודציל סולפט (SDS). בהוספת זאת, נפח הדגימה מגיע ל-1.5 מ"ל, ויש ריכוז סופי של 0.5 NOH וריכוז סופי של 1% SDS.

7. לדוגר את התערובת הזו ב-RT ל-60 דקות ו-80 סל"ד. הוספת בסיס וחומרי ניקוי תעזור בפירוק הסופי של התא. ריכוז חומרי הניקוי הללו אופטימלי כך שלא יפגעו באנדוספורות בזמן ליסיזציה של תאים וגטטיביים.

8. הכינו יחידת סינון סטרילית שמחזיקה ממברנות בקוטר 25 מ"מ על ידי אוטוקלב, או (אם זכוכית פיירקס) ריסוס של 70% אתנול והדלקת השריפה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר.

9. מניחים ממברנת NC בקוטר 0.2 מיקרון (קוטר 25 מ"מ) על יחידת הסינון באמצעות מלקחיים מחוקרים בלבת אתנול.

10. הוסף את הדגימה משלב 4.7 לממברנה ומסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. כאשר הנוזל עבר, כבה את משאבת הוואקום. בשלב זה, חומר התא הצמחוני המפולל מוסר משום שאינו נשמר על הממברנה. רק האנדונבגים יישארו על הממברנה.

11. הוסף 2 מ"ל תמיסה פיזיולוגית סטרילית לשטיפה של חומרי ניקוי שאריות וסינון הנוזל באמצעות משאבת הוואקום.

12. כאשר הנוזל מסונן במלואו, כבה את משאבת הוואקום. השאירו את הממברנה על יחידת הסינון.

חומרים