חסימת שכפול מתווכת חלבון מדכא פלואורסצנטית באשריכיה קולי

תקציר

מקור: מטריק, ק. א., לורנס ואחרים, השראת חסימת שכפול ספציפית לאתר ב-E. coli באמצעות מערכת מפעילי מדכא פלואורסצנטי. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים חסימת מזלג שכפול ספציפית לאתר ב-Escherichia coli באמצעות ביטוי מושרה על ידי ערבינוז של TetR חלבון פלואורסצנטי צהוב המתויג בקשר למערכי טטו כרומוזומליים.

פרוטוקול

1. חסימת שכפול באמצעות מערכת מפעיל מדכאי פלואורסצנציה (FROS)

1. יצירת חסימת השכפול
   1. דילל תרבית לילה חדשה של זן E. coli הנושא מערך טטO ו-pKM118 עד OD₆₀₀ננומטר = 0.01 במדיום מורכב מדולל (0.1% טריפטון, 0.05% תמצית שמרים, 0.1% NaCl, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 M K₂HPO₄) עם אנטיביוטיקה לפי הצורך לבחירה.
      הערה: אין להוסיף טטרציקלין לצורך בחירה כי הוא אינו תואם למערכת זו. הפכו את נפח התרבית לשווה ל-10 מ"ל לכל דגימה נדרשת. לדוגמה, נפח התרביות לעיצוב הניסוי באיור 1 הוא 60 מ"ל.
   2. גדל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור עד ל-OD₆₀₀ ננומטר = 0.05-0.1. הסרת דגימה של 10 מ"ל שתשמש כבקרה לא מושרה והוסיפה 0.1% ערבינוז לתרבית הנותרת כדי לעודד ייצור TetR-YFP מ-pKM1. המשך לגדל גם את התרביות הלא מונעות וגם את התרביות המושרות. לאחר שעה, יש לבדוק אם יש נקודת מוקד אחת בכל תא בתרבות המושרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   3. אם התאים המושרים מאושרים כחסומים (יותר מ-70% מהתאים בעלי מוקד יחיד), הקלט את_{ה-OD 600}ננומטר ולקח דגימה של 7.5 מ"ל לניתוח על ידי ג'לים דו-ממדיים. קחו דגימה מקבילה מתרבות הבקרה הלא מושרת.

תוצאות

איור 1: סקירה של הליך ניסויי של בלוק ושחרור שכפול FROS. זני E. coli הנושאים את מערך הטטו גדלים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מגיעים_{ל-OD של 600}ננומטר מעל 0.05, ייצור TetR-YFP מושרה באמצעות ערבינוז (ara; 0.1%). המשך...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריפטון	סיגמא-אלדריץ'	16922	רכיב מדיה צמיחה
כלוריד נתרן	VWR	27810.364	רכיב מדיה צמיחה
תמצית שמרים	סיגמא-אלדריץ'	92144	רכיב מדיה צמיחה
אסלגן פוספט מונובסיסי	סיגמא-אלדריץ'	P9791	רכיב מדיה לצמיחה; רכיב בופר אשלגן
פוספט אשלגן די-בסיסי	סיגמא-אלדריץ'	P3786	רכיב מדיה לצמיחה; רכיב בופר אשלגן
ל-ערבינוז	סיגמא-אלדריץ'	A3256	לצורך הכנסת ייצור TetR-YFP
מיקרוסקופ פלואורסצנציה Axioskop 2	צייס	452310	ויזואליזציה של תאים
סט מסנני eYFP	טכנולוגיית כרומה	41028	הדמיית YFP
מצלמת CCD	המאמאצו	אורקה-AG	ויזואליזציה של תאים
תוכנת MetaMorph (מכשירים מולקולריים)	SDR מדעי	31282	גרסה 7.8.0.0 ששימשה בהכנת כתב יד זה