הגברה איזותרמית בתיווך לולאה לזיהוי גנים חיידקיים

תקציר

מקור: דומסל, ק. ג'. ואחרים. הגברה איזותרמית מתווכת לולאה לסינון סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבית. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את טכניקת ההגברה האיזותרמית המתווכת בלולאה (LAMP) לזיהוי גן חיידקי מטרה על ידי הגברת DNA בטמפרטורה קבועה. תערובת התגובה מוכנה על ידי הוספת תערובת מאסטר איזותרמית, פריימרים ספציפיים לגן היעד, ודגימות המכילות תבניות DNA. ההגברה מתחילה במכשיר LAMP ומפוטרת פלואורסצנציה בזמן אמת כדי לאשר את נוכחות הגן היעד.

פרוטוקול

הערה: תערובת תגובה איזותרמית (LAMP) המתווכת בלולאה מכילה DNA פולימראז, בופר, סולפט מגנזיום (MgSO₄), טריפוספטים דה-אוקסינוקלאוטידים (dNTPs), פריימרים, תבנית DNA ומים. ארבעת המגבים הראשונים נמצאים בתערובת מאסטר איזותרמית (טבלת חומרים). הפריימרים מעורבבים מראש בתוך החברה כדי להפוך לתערובת פריימר (10x). ניתן להכין תבניות DNA ממרקי העשרה של דגימות מזון לבעלי חיים לצורך סינון או מתרביות של מבודדי סלמונלה משוערים לצורכי אישור. בנוסף, בקרה חיובית (DNA שהופק מכל זן ייחוס לסלמונלה , לדוגמה, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) ומערכת בקרה ללא תבנית (NTC; מים סטריליים בדרגה מולקולרית) נכללים בכל ריצת LAM.

1. הכנת תבניות DNA

1. כדי להכין תבניות DNA מחומרי העשרת מזון לבעלי חיים, עקבו אחר השלבים הבאים.
   1. שקלו אספטית 25 גרם של דגימת מזון לבעלי חיים (למשל, מזון חתולים יבש, מזון כלבים יבש, מזון לבקר, מזון לסוסים, מזון לעופות ומזון לחזירים) לתוך שקית סינון סטרילית (טבלת חומרים), או מקבילה. הנח את השקית במיכל או מתקן גדול לתמיכה במהלך הדגירה.
   2. הוסף 225 מ"ל של מי פפטון סטריליים (BPW). ערבב היטב על ידי סיבוב ועיסוי יד קצר. תן לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 60 ± 5 דקות.
   3. ערבב היטב על ידי סיבוב וקבעו pH עם מבחן מבחן. כוונו את ה-pH, במידת הצורך, ל-6.8 ± 0.2 עם 1 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) או 1 N חומצה הידרוכלורית (HCl) סטרילית. דגרו בטמפרטורה של 35 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 24 ± 2 שעות.
   4. ערבבו היטב על ידי סיבוב השקית המכילה מרקי העשרה למזון מהחי. העבר 1 מ"ל מהצד המסונן של השקית לצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבולת לרגע.
   5. חילוץ DNA באמצעות תגובת הכנת דגימה (טבלת חומרים) כדלקמן.
      1. צנטריפוגה בעוצמה של 900 x g למשך דקה אחת להסרת חלקיקים גדולים והעברת סופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      2. צנטריפוגה בעוצמה של 16,000 x g למשך 2 דקות וזרקו סופרנטנט.
      3. השעה את הכדור ב-100 מיקרוליטר של תגובת הכנת הדגימה וחמם בטמפרטורה של 100 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום יבש.
      4. מקררים לטמפרטורת החדר ואחסנו את תמציות ה-DNA של הדגימה בטמפרטורה של מינוס 20°C.
2. כדי להכין תבניות DNA מתרבויות סלמונלה משוערות, עקוב אחר השלבים הבאים.
   1. השגת בידוד סלמונלה משוער מבידוד תרבית בכל המזונות בהתאם ל-BAM פרק 5 של ה-FDA, פרק D: בידוד סלמונלה.
   2. להחליד סלמונלה משוערת מבודדת על פלטת אגר לא סלקטיבית (למשל, אגר דם, אגר תזונתי ואגר סויה טריפטיקז) ודגירה בטמפרטורה של 35 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 24 ± 2 שעות.
   3. העבר מספר מושבות בודדות ל-5 מ"ל ציר טריפטיקאז סויה (TSB) או מרק עירוי לב מוחי (BHI) ודגור בטמפרטורה של 35 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 16 ± 2 שעות.
      הערה: שלב זה יכול להיות אופציונלי אם תרבות הסלמונלה המשוערת טהורה. במקרה כזה, ניתן להכין תבניות DNA על ידי השעיית מספר מושבות בודדות ב-5 מ"ל של TSB וחימום 500 מיקרולטר מהמתלה בטמפרטורה של 100 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום יבש. המשך עם שלב 5 למטה.
   4. העבר 500 מיקרוליטר מהתרבית ללילה לצינור מיקרוצנטריפוגה וחמם בטמפרטורה של 100 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום יבש.
   5. קרר לטמפרטורת החדר ואחסן תמציות DNA מבודדות בטמפרטורה של -20°C.
3. להכנת DNA בקרה חיובית, יש לעקוב אחר שלבים דומים לאלו לעיל להכנת תבניות DNA מתרביות סלמונלה משוערות עם שלב דילול נוסף.
   1. חיסון S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) או כל זן ייחוס לסלמונלה על פלטת אגר לא סלקטיבית (למשל, אגר דם, אגר מזין ואגר טריפטיקאז סויה) ודגר בטמפרטורה של 35 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 24 ± 2 שעות.
   2. העבר מספר מושבות בודדות ל-5 מ"ל של מרק TSB או BHI ודגור בטמפרטורה של 35 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 16 ± 2 שעות כדי להגיע ל-~10⁹ CFU/mL.
   3. דילל סדרתי את התרבית הלילית במי פפטון של 0.1% כדי לקבל ~10⁷ CFU/mL.
   4. העבר 500 מיקרוליטר מדילול זה לצינור מיקרוצנטריפוגה וחמם ב-100 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום יבש.
   5. קרר לטמפרטורת החדר ואחסן DNA בקרה חיובית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תערובת הפריימר (10x)

1. השגת פריימרים מסחריים של LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF ו-Sal4-LB) עם טיהור סטנדרטי להסרת מלח (טבלה 1). הכינו תמיסות מלאיות של כל פריימר (100 מיקרומון) על ידי הידרציה מחודשת של הפריימר בכמות מתאימה של מים מולקולריים סטריליים. ערבב היטב על ידי מערבולת במשך 10 שניות ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C (-80°C לאחסון ארוך טווח).
2. הכינו את תערובת הפריימר (10x) לפי גיליון עבודה (טבלה 2). הוסיפו נפחים מתאימים של תמיסות פריימר ומים סטריליים בדרגה מולקולרית לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. ערבב את כל החומרים היטב על ידי מערבולת למשך 10 שניות. העלו את תערובת הפריימר של 10x ל-500 מיקרוליטר לכל צינור מיקרוצנטריפוגה ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

3. הרכבת תגובת LAMP

הערה: כדי למנוע זיהום צולב, מומלץ מאוד להפריד פיזית את האזורים המשמשים להכנת תערובת המאסטר של LAMP והוספת תבניות DNA. איור 1 הוא דיאגרמת LAMP (LAMP diagram).

1. הכנה והכנה לריצה
   1. ספסל נקי עם איזופרופנול ותמיסה מפירוק DNA ו-DNase (טבלת חומרים). נקי פיפטות ומחזיקי רצועות צינורות (טבלת חומרים) עם תמיסת פירוק DNA ו-DNase.
   2. הפשרה של תערובת המאסטר איזותרמית, תערובת הפריימר (10x), מים בדרגת מולקולות, DNA בקרה חיובית ותבניות DNA בטמפרטורת החדר.
   3. הפעל את כלי ה-LAMP (טבלת החומרים) והקש על מסך הפתיחה כדי לגשת למסך הבית. עקבו אחרי השלבים האלה כדי ליצור ריצה.
      הערה: דגם אחד של כלי LAMP כולל 2 בלוקים (A ו-B) עם 8 דגימות בכל בלוק, ודגם אחר כולל בלוק יחיד שמכיל 8 דגימות (טבלת חומרים).
      1. הקש על LAMP+Anneal ובחר עריכה כדי להזין מידע לדוגמה.
         הערה: פרופיל הריצה ברירת המחדל של LAMP כולל הגברה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ושלב אניל מ-98 עד 80 מעלות צלזיוס עם ירידה של 0.05 מעלות צלזיוס לשנייה.
      2. הקש על כל שורת דגימה כדי להפעיל את הסמן ולהכניס מידע רלוונטי לדגימה, תוך שימוש באייקון בלוק AB כדי לעבור בין שני בלוקי הכלים של LAMP במכשירים.
      3. הקש על סמל הבדיקה כאשר כל המידע לדוגמה הוזן.
         הערה: באופן אופציונלי, הגדרת הריצה (הנקראת "פרופיל", שמכילה מידע לדוגמה יחד עם פרופיל הריצה המוגדר כברירת מחדל של LAMP ניתנת לשימוש) יכולה להישמר לשימוש מאוחר יותר. הקש על אייקון השמירה ותן לפרופיל שם ייחודי. כשבודקים את אותו סט דגימות בפעם הבאה, ניתן להתחיל ריצה חדשה באמצעות הפרופיל השמור. הקש על אייקון התיקייה בפינה השמאלית התחתונה של מסך הבית ובחר פרופיל כדי לטעון פרופילים ששמרו.
2. מכלול תגובת LAMP
   הערה: בעת שימוש בשני בלוקי כלי ה-LAMP (A ו-B, סך הכל 16 דגימות), יש להכין את המיקס הראשי של LAMP ל-18 דגימות. אם משתמשים רק בבלוק כלי LAMP אחד (8 דגימות בסך הכל), יש להכין את המיקס הראשי של LAMP ל-10 דגימות. למספרי דגימות אחרים, כוון את הנפח בהתאם כדי להתאים לאובדן פיפטינג. תמיד כלול בקרה חיובית ו-NTC בכל ריצת LAMP שלך. מומלץ לבצע בדיקות כפולות של כל דגימה בריצות LAMP עצמאיות.
   1. הכינו את תערובת המאסטר של LAMP לפי גיליון עבודה (טבלה 3). הוסף נפחים מתאימים של תערובת האיזותרמית הראשית, תערובת הפריימר ומים בדרגת מולקולרית לצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבולת בעדינות למשך 3 שניות. צנטריפוגה לזמן קצר.
   2. הנח את רצועת הצינור במחזיק הרצועה וחלק 23 מיקרו ליטר של תערובת המאסטר של LAMP לכל באר.
   3. מערבולות את כל תבניות ה-DNA והצנטריפוגה לזמן קצר. הוסיפו 2 מיקרו ליטר של תבנית DNA לבאר המתאימה וסגרו היטב.
   4. הסר את רצועת הצינור מהמחזיק והזיז את פרק כף היד כדי לוודא שכל החומרים הצטברו בתחתית הצינור.
   5. טען את רצועת הצינור לבלוק(ים) של כלי ה-LAMP כדי לוודא שהפקקים מאובטחים לפני סגירת המכסה.

4. ריצה של המנורה

הערה: במהלך ריצת LAMP נרכשות קריאות פלואורסצנציה באמצעות ערוץ FAM. ערכי הזמן לשיא (Tmax; מינימום) נקבעים אוטומטית על ידי המכשיר לנקודת הזמן שבה יחס הפלואורסצנציה מגיע לערך המקסימלי של עקומת קצב ההגברה. ה-Tm (°C) היא טמפרטורת ההתכה/האנילה של המוצר המוגבר הסופי.

1. לחצו על סמל הריצה בפינה הימנית העליונה של המסך ובחרו את הבלוק(ים) המכילים רצועות הצינורות כדי להתחיל את ריצת ה-LAMP (LAMP run).
2. באופן אופציונלי, בזמן שהתגובה מתבצעת, יש להקיש על לשוניות Temperature, Amplification ו-Anneal כדי לראות שינויים דינמיים בפרמטרים שונים במהלך ריצת ה-LAM.
3. לאחר סיום הריצה, הקישו על לשוניות ההגברה והאניל כדי לראות הגברה מלאה ועקומות אניל, ולחצו על לשונית התוצאות כדי לצפות בתוצאות.
4. באופן אופציונלי, לצורך שמירת רשומות, יש להקליט את מספר הריצה הממוקם בפינה השמאלית העליונה של המסך, בפורמט "מספר סידורי number_run לכלי נגינה", לדוגמה, "GEN2-2209_0030."

טבלה 1: מדריך LAMP לסינון סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבית. הפריימרים מעוצבים על פי רצף סלמונלה invA (מספר גישה של GenBank M90846).

שם ראשי	תיאור	רצף (5'-3')	אורך (bp)
Sal4-F3	פריימר חיצוני קדמי	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	פריימר חיצוני הפוך	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	פריימר פנימי קדמי	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	פריימר פנימי הפוך	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	פריימר קדימה בלולאה	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	פריימר לולאה לאחור	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

טבלה 2: דף עבודה להכנת תערובת הפריימר של LAMP (10x). המבנים מפורטים בטבלה 1.

רכיב	קונצרט מלאי (μM)	פריימר מיקס קונקסנציונלי (μM)	נפח (μL)
פריימר Sal4-F3	100	1	10
פריימר Sal4-B3	100	1	10
פריימר Sal4-FIP	100	18	180
פריימר Sal4-BIP	100	18	180
פריימר Sal4-LF	100	10	100
פריימר Sal4-LB	100	10	100
מים בדרגה מולקולרית	לא זמין	לא זמין	420
סך	לא זמין	לא זמין	1000

טבלה 3: דף עבודה להכנת תערובת תגובת LAMP. תערובת הפריימרים (10x) מוכנה לפי טבלה 2 באמצעות תמיסות סטוק של פריימרים המפורטים בטבלה 1.

רכיב	עבודה קונקציונלית.	תגובה סופית: קונצ'ר.	נפח לדגימה (μL)	נפח ל-18 דגימות (μL)	נפח ל-10 דגימות (μL)
תערובת מאסטר איזותרמית של ISO-001	1.67x	1x	15	270	150
תערובת פריימר	10 פעמים	1x	2.5	45	25
מים בדרגה מולקולרית	לא זמין	לא זמין	5.5	99	55
תת-סכום המיקס הראשי	לא זמין	לא זמין	23	414	230
תבנית DNA	לא זמין	לא זמין	2	לא זמין	לא זמין

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה של Salmonella LAMP (LAMP של סלמונלה).

חומרים