אספקה מבוססת אלקטרופורציה של ביומולקולות פלואורסצנטיות לתאי חיידק

תקציר

מקור: אייגריין, ל. , ואחרים. הפנמה ותצפית על מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות במיקרואורגניזמים חיים באמצעות אלקטרופורציה. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מדגים את העברת מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות לתאים מיקרוביאליים בעלי יכולת אלקטרופוטית באמצעות אלקטרופורציה. התהליך מתחיל בהכנסת DNA או חלבונים מסומנים בפלואורופור לתוך תליית תא מקורר. לאחר מכן מופעל פולס במתח גבוה ליצירת נקבוביות ממברנה זמניות, המאפשרת כניסת ביומולקולה לציטופלזמה. לאחר ההתאוששות, התאים עוברים שטיפה וסינון להסרת מולקולות שאינן פנימיות או קשורות למשטח. לבסוף, התאים המסומנים מותקנים להדמיה פלואורסצנצית כדי להמחיש רכיבים תוך-תאיים.

פרוטוקול

1. אלקטרופורציה

1. דגירה
   1. הוסיפו עד 5 מיקרוליטר מולקולות מסומנות המאוחסנות בבופר דל מלח (< 50 מ"מ מלח) לאליקו אחד של תאים מיומנים (20 מיקרוליטר חיידקים או 50 מיקרוליטר שמרים) ודגרו במשך 10 דקות על קרח.
      הערה: ריכוז המולקולות המסומנות בפלואורסצנציה בתמיסות המקור ולכן כמות המולקולות המסומנות שנוספו לתא לפני האלקטרופורציה קשורים ישירות ליעילות העומס (איור 1 ודיון). מכיוון שחלק מהחלבונים פחות תואמים לתנאי מלח נמוכים, ריכוז המלח בבופר האחסון עשוי לעלות, אך יש להפחית את נפח המולקולות המסומנות שנוספו לתאים לפני האלקטרופורציה.
   2. העבר את תערובת התאים והמולקולות הביולוגיות המסומנות לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש (מרווחים של 0.1 ו-0.2 ס"מ בין חיידקים לשמרים, בהתאמה). טפחו בעדינות על הקובטה על הספסל כדי להסיר בועות פוטנציאליות מהתמיסה.
   3. הכניסו את הקובטה לאלקטרופורטור והחלו פולס חשמלי במתח גבוה על התמיסה (0.9 עד 1.8 קילו-וולט/ס"מ, ראו דיון לפרטים נוספים על בחירת מתח). פולס כזה יוצר נקבוביות חולפות בממברנות התא, ומאפשר לביומולקולות מסומנות להתפשט לתוך התאים.
   4. בדוק שקבוע הזמן המוצג על האלקטרופורטור הוא בין 4 ל-6 מילישניות. קבועי זמן נמוכים נובעים לעיתים מריכוז מלח גבוה מדי ו/או נוכחות בועות בקובט, והם יובילו לעומס נמוך מאוד או ללא עומס על התאים.
2. שחזור
   1. מיד לאחר האלקטרופורציה, הוסיפו 500 מיקרול של מדיום עשיר כגון Super Optimal Broth עם Catabolite repression (SOC), EZ Rich Defined Medium, תמצית שמרים עם פפטון דקסטרוז (YPD), או כל מדיום עשיר לתאים.
   2. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחיידקים ו-29 מעלות צלזיוס לשמרים למשך 2 עד 10 דקות. למדידות כדאיות, כאשר המשתמש רוצה להעריך את אחוז התאים שגדלים ומתחלקים לאחר האלקטרופורציה, השתמש בזמן התאוששות ארוך יותר (עד שעה) שכן אנו צופים בזמני השהייה כאלה לפני חלוקת התא הראשונה.
3. מדרגות כביסה
   1. שטוף את התאים להסרת מולקולות ביולוגיות לא פנימיות על ידי סיבוב התאים למשך דקה בטמפרטורה של 3300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט והחזיר את התאים ל-500 מיקרוליטר מלח פוספאט-בופר (PBS).
      הערה: לכל דגימה, יש להכין בקרה שלילית של תאים שדוגרו עם אותה כמות של ביומולקולות מסומנות אך לא אלקטרופורטיביים ושטפו בדיוק כמו הדגימה הראשית.
   2. חזור על השלבים הקודמים 3 פעמים.
   3. במקרה של הפנמת חלבון, יש לייעל את תהליך הכביסה בהתאם לתכונות ולהתנהגות של החלבון המסומן. השלבים הבאים הם דוגמאות לאופטימיזציות אפשריות:
      1. בצע את שלושת מחזורי השטיפה הראשונים באמצעות PBS המכיל 100 mM NaCl ו-0.005% Triton X-100 כדי להסיר חלבונים לא מופנמים שעלולים להידבק לממברנת התא החיצונית.
         1. סננו את התאים האלקטרופוריים באמצעות מסנן נקבובית בקוטר 0.22 מיקרון, המותקן בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל על ידי פיפטר התאים האלקטרופוריים אל תוך המסנן. סובב למטה 3 דקות בטמפרטורה של 800 x g ו-4 מעלות צלזיוס. השליך את הזרימה. הוסף 500 מיקרו-ליטר של PBS חדש מעל התאים וסובב אותם שוב כמו קודם, וחזור על השלבים האלה פעם אחת.
      2. הוסיפו כמות קטנה של פרוטאז K (10 ng ב-500 מיקרוליטר PBS) במהלך מחזור השטיפה הראשון כדי לאפשר עיכול של חלבון לא פנימי.
   4. סובבו את התאים לדקה אחת בטמפרטורה של 3300 x g ו-4 מעלות צלזיוס. זרקו את הסופרנטנט והחזירו את התאים ל-150 מיקרוליטר של PBS.
   5. מפזרים את תמיסת התא הטעונה על כרית האגרוז על ידי הסרת הכיסוי העליון ופיזור 10 מיקרו-ליטר מטיפה תליית התא טיפה אחר טיפה. החלפת כיסוי נקי ושרוף שלא בשימוש (בעובי 1.5, תואם את מפרט מטרת המיקרוסקופ) בחלק העליון של המשטח ולחץ בעדינות רבה על המחסנית.
   6. הגנו על התאים האלקטרופוריים מאור על ידי אחסון הפדים בקופסה אטומה תוך כדי הדמיית דגימות שונות.

תוצאות

איור 1: ספירת מספר המולקולות הפנימיות באמצעות ניתוח פוטובלינצ'ינג. (א) ניתוח פוטובלינינג חד-תאים. דוגמאות לזמני עוצמת פלואורסצנציה (כחול: נתונים גולמיים; אדום: התאמה; אינסטים: WL ותמונות פלואורסצנציה של E. coli טעון...

חומרים