הכנת דגימות מיקסוקוקוס קסנתוס להדמיה של תאים חיים

תקציר

מקור: שומאכר, ד. ואחרים. הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של מחזור התאים הצמחיים המלא של החיידק החברתי המתפתח באיטיות Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים את ההכנה וההדמיה של Myxococcus xanthus, חיידק קרקע שגדל לאט. התרבית גדלה במדיום, מונחת על כיסוי עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות, ומעליה כרית אגרוז מחוממת מראש לתמיכה בהידרציה ואספקת חומרים מזינים. מערך זה מאפשר הדמיה חיה ארוכת טווח של תהליכים תאיים בזמן חלוקת תאים חיידקיים.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות מיקרוסקופיה

הערה: תאים שיש לצפות בהם במיקרוסקופ מונחים על כיסוי מיקרוסקופ ואז מכוסים בכרית אגרוז המכילה חומרים מזינים. הכיסוי מודבק למסגרת פלסטיק או מתכת כדי לספק תמיכה מכנית. כהכנה למיקרוסקופיה, יש להכין מראש משטח גדול של 1% אגרוז/TPM/0.2% CTT כפי שמתואר בשלבים 2.1 - 2.3. אנא עיין גם בטבלת החומרים עבור מוצרים ספציפיים בהם משתמשים כאן.

1. הכינו 500 מ"ל של בופר TPM (10 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 1 מ"מ KH₂PO₄ pH 7.6, 8 מ"מ MgSO₄) וחטא אוטוקלאב או מסנן באמצעות פילטר על הבקבוק.

הערה: הבופר הסטרילי יכול להיאחסן במשך מספר חודשים בטמפרטורת החדר.

2. הכינו תמיסת מיקרוסקופ אגרוז 1% המכילה 0.2% CTT (ערבב 1 גרם אגרוז עם 80 מ"ל בופר TPM ו-20 מ"ל של מדיום CTT 1%). חממו במיקרוגל עד שהאגרוז מותך.

הערה: ה-CTT של 0.2% מספיק כדי לאפשר לתאים לגדול ולמנוע רעב. ריכוזים גבוהים יותר של CTT במדיעת מיקרוסקופיה יובילו לפלואורסצנציה גבוהה ברקע.

3. למלא צלחת פטרי באגרוז מותך בעובי של 0.5 ס"מ (עבור צלחת פטרי מרובעת בגודל 11.5 ס"מ על 11.5 ס"מ, נדרש כ-60 מ"ל של אגרוז מותך) ותן לה להתקרר לטמפרטורת החדר.

הערה: משטח האגרוז יכול להיאחסן בטמפרטורה של 4°C בסביבה לחה למשך עד יומיים.

1. חממו מראש את משטח ה-1% אגרוז/TPM/0.2% CTT בטמפרטורה של 32°C לפחות 15 דקות לפני השימוש.

הערה: כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה, עקבו אחר שלבים 2.4 - 2.8.

4. מניחים כיסוי זכוכית סטרילי (60 מ"מ x 22 מ"מ, עובי: 0.7 מ"מ) על מסגרת פלסטיק או מתכת שיש לה חור במרכז (איור 1A); מסגרת זו משמשת כתמיכה מכנית לכיסוי הדק ועוזרת להפחית סחיפה במהלך מיקרוסקופיה. תחבר את הכיסוי למסגרת עם סרט דבק.

1. להכנת המסגרת, חתכו מסגרת בגודל 75 מ"מ × 25 מ"מ מפלטת מתכת בעובי 1 מ"מ, ואז חתכו חור בגודל מתאים (20 מ"מ × 30 מ"מ בניסוי זה) במרכז.

5. הוסף 10 - 20 מיקרוליטר של תאי M. xanthus שגדלו באופן מעריכי על הכיסוי.

6. הוספת מיקרוספירות פלואורסצנטיות של 0.5 מיקרון כסמנים פידוציאליים לתאים כדי לפשט את מעקב התאים או החלבונים ברישום טיים-לאפס.

1. מדללים את המיקרוספירות ב-1:100 במאגר TPM ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד מספר חודשים. נערו היטב לפני השימוש והוסיפו 5 - 10 מיקרוליטר מהמיקרוספירות המדוללות לתאים.

הערה: כאן נעשה שימוש במיקרוספירות פלואורסצנטיות בכל התעלות הפלואורסצנטיות הכחולות, הירוקות, הצהובות והאדומות הרגילות.

7. חתוך כרית קטנה בגודל של הכיסוי של כרית הכיסוי הגדולה המחוממת מראש 1% אגרוז/TPM/0.2% CTT והניחו אותה מעל התאים (איור 1B). הניחו כיסוי מעל כרית אגרוז 1% אגרוז/TPM/0.2% CTT אגרוז כדי למנוע אידוי ולשמור על תאים בסביבה לחה.

הערה: הכיסוי לבדו ימנע אידוי משמעותי למשך לפחות שעתיים. להקלטות טיימלפס ארוכות יותר, יש לאטום את כרית 1% אגרוז/TPM/0.2% CTT וסנדוויץ' כיסוי עם סרט פרפין למניעת אידוי.

8. דגרו את דגימת המיקרוסקופיה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך 15 - 20 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית כרית האגרוז. ואז תתחילו את הקלטות המיקרוסקופיה בזמן-לאפס.

תוצאות

איור 1: סכמטי של המבנה הניסויי ששימש לאורך כל המחקר הזה. (א) מסגרת מתכתית או פלסטית משמשת כתמיכה לדגימה. מגן כיסוי מחובר למסגרת המתכת עם סרט להפחתת תנועת הדגימה. (ב) תצוגת צד של מערך הדגימה הניסיוני. התאים מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMI6000B עם AFC	לייקה מיקרוסיסטמס	11888945	מיקרוסקופ פלואורסצנציה רחב-שדה אוטומטי הפוך עם בקרת מיקוד אדפטיבית
מסגרת התקנה אוניברסלית	לייקה מיקרוסיסטמס	11532338	מחזיק במה לגדלים שונים של מדגמים
HCX PL FLUOTAR 100X/1.30 שמן PH3	לייקה מיקרוסיסטמס	11506197	מטרת ניגודיות פאזה
מצלמת אורקה פלאש 4.0	המאמאצו	11532952	מצלמת sCMOS ברזולוציה של 4.0 מגה-פיקסל לרכישת תמונה
קבוצת מסננים TXR ET, k	לייקה מיקרוסיסטמס	11504170	סט פילטר פלואורסצנטי, Ex: 560/40 Em: 645/75
קבוצת מסננים L5 ET, k	לייקה מיקרוסיסטמס	11504166	סט פילטר פלואורסצנצי, Ex: 480/40 Em: 527/30
הגדרת המסננים YFP ET, k	לייקה מיקרוסיסטמס	11504165	סט פילטר פלואורסצנציה, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	לפני	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	בקר אוטומציה מיקרוסקופ עם מרכז בקרה אינטראקטיבי
מקור אור EL 6000	לייקה מיקרוסיסטמס	11504115	מקור אור פלואורסצנציה חיצוני
חממת BLX שחור	פקון	11532830	תא דגירה שחור סביב המיקרוסקופ
Tempcontrol 37-2 דיגיטלי	לייקה מיקרוסיסטמס	11521719	בקרת טמפרטורה אוטומטית לתא הדגירה
גופרית גנטמיצין	קארל רות'	233.4	גנטמיצין
אוקסיטטרצילין דיהידראט	סיגמא אולדריץ'	201-212-8	אוקסיטטרציקלין
סולפט קאנמיצין	קארל רות'	T832.3	קאנמיצין
פילטרופור BT25 0.2 מסנן מכסה בקבוק	סארסטדט	831,822,101	מסנן על גג הבקבוק לעיקור בופרים
Deckgläser	VWR	630-1592	כיסוי זכוכית (60 x 22 מ"מ, עובי: 0.7 מ"מ)
Seakem LE agarose	לונזה	50004	אגרוז לשקופיות מיקרוסקופיה
לייקה מטמורף AF	לייקה מיקרוסיסטמס	11640901	תוכנות לבקרת מיקרוסקופ ותוכנה לניתוח תמונות
מיקרוספרים טטרספקים, 0.5 מיקרומטר	תרמופישר	T7281	מיקרוספירות פלואורסצנטיות
צלחת פטרי	גריינר ביו-וואן	688102	צלחת פטרי מרובעת בגודל 120 מ"מ x 120 מ"מ x 17 מ"מ לרפידות אגרוז
BD Bacto Casitone	בקטון דיקינסון	225930	קסיטונה
פאראפילם M	VWR	291-1213	פאראפילם
טריס(הידרוקסימתיל)-אמינומתאן	קארל רות'	AE15.2	טריס
מגנזיום סולפט הפטהידרט	קארל רות'	P027.2	מגנזיום סולפט
אשלגן דיהידרוגן פוספט p.a.	קארל רות'	3904.1	אשלגן דיהידרוגן פוספט
1% CTT בינוני: 1% (בלי v) BD™ בקטו קסיטון, 10 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ"מ באפלגן פוספט pH 7.6, 8 מ"מ MgSO₄			מדיום גידול ל-M.xanthus
בופר TPM: 10 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ"מ באפלגן פוספט pH 7.6, 8 מ"מ MgSO₄			מאגר להכנת שקופיות מיקרוסקופיה ל-M.xanthus