ניתוח מדויק ומהיר של צמיחת חיידקים באמצעות קורא מיקרופלט

תקציר

מקור: קורוקאווה, מ. ואחרים. ניתוח מדויק ומהיר של צמיחת חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון הזה מדגים את הכימות בתפוקה גבוהה של צמיחת חיידקים באמצעות קורא מיקרופלט. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהכנת תרבית, מדידת צפיפות אופטית וניתוח דינמיקת צמיחה.

פרוטוקול

1. תיעוד בזמן אמת של צמיחה
   1. צייר פיקטוגרמה של 96 בארות (טבלת 8 × 12) כדי לציין את מיקומי דגימות התרבית המחוסנות על לוח 96 בארות. הדפיסו את הטבלה והשתמשו בה כהפניה לניסוי.
      הערה: הבארות הממוקמות בקצוות המיקרופלטה צריכות להכיל רק חומר ריק בגלל אידוי.
   2. הניחו מיקרופלטה שטוחה עם תחתית שטוחה עם 96 בארות מעוקר עם מכסה, P-1000, קצות פיפטה בנפח 1000 מיקרוליטר, P-200, קצות פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר, מספר מיקרופנופריות 1.5 מ"ל, פיפטה רב-ערוצית, מאגר תגובת סטרילי, M63 בטמפרטורת החדר ומאגרי גליצרול Escherichia coli על ספסל נקי.
   3. הוסיפו כ-25 מ"ל M63 למאגר המגנים. השתמש במאגר זה לכל השלבים הבאים.
   4. הוסף 900 מיקרוליטר M63 למיקרופופרות כהכנה לייצור דילול סדרתי.
   5. הפשיר את מלאי הגליצרול בטמפרטורת החדר. הוסיפו 900 מיקרוליטר M63 למאגר הגליצרול המופשר ולוורטקס. כתוצאה מכך, דילול פי עשרה של מלאי הגליצרול המקורי.
   6. העבר 100 מיקרוליטר מדילול 10 הכפולים למיקרוצינור אחר המכיל 900 מיקרוליטר M63 ומערבולת. זה מוביל לדילול פי 100.
   7. חזור על שלב 1.6 עד להשגת מספר הדילול הרצוי.
   8. מלאו את הבארות בקצה המיקרופלטה ב-200 מיקרוליטר M63 באמצעות פיפטה בעלת 8 ערוצים (P-200).
      הערה: בארות אלו יכולות לשמש כבארות ריקות.
   9. העמס 200 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת שהוכנה בשלבים 1.4 - 1.7 לבארות המיקרופלטה לפי טבלת ההתייחסות (שלב 1.1). מערבל את הדגימות המדוללות לפני הטעינה וטעין את אותה דגימה במספר בארות במיקומים שונים על הלוח.
   10. הנח את המיקרופלטה עם 96 באר על קורא הלוחות.
   11. פתח "Read Now" ב"Task Manager" ובחר את התוכנית. לחץ על "אישור" כדי להתחיל למדוד. שמור את ההקלטה כקובץ ניסויי חדש לניתוח נתונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט די-אשלגן	וואקו	164-04295
מונואשלגן פוספט	וואקו	166-04255
סולפט אמוניום	וואקו	019-03435
מגנזיום סולפט הפטהידרט	וואקו	138-00415
תיאמין-HCl	וואקו	201-00852
גלוקוז	וואקו	049-31165
HCl	וואקו	080-01066
ברזל (II) סולפט הפטהידרט	וואקו	094-01082
KOH	וואקו	168-21815
גליצרול	וואקו	075-00611
קצות פיפטה, 200 מיקרוליטר	ווטסון	110-705Y
קצות פיפטה, 1,000 מיקרוליטר	ווטסון	110-8040
מיקרוטיוב (1.5 מ"ל)	ווטסון	131-715C
8 פיפטה רב-ערוצית	ווטסון	NT-8200
פאסורינה סטילרר	כאחד	2-4990-02
גליל זכוכית (200 מ"ל)	כאחד	1-8562-07
מד pH מדויק	כאחד	AS800 / 1-054-01
פיפטמן P-200	גילסון	1-6855-05
פיפטמן P-1000	גילסון	1-6855-06
מעמד מיקרוטיוב	ביוגרפיה של BM	801-02Y
מערבולת	ביוגרפיה של BM	BM-V1
לוחית מיקרופלטה Corning Costar 96 באר עם מכסה (תחתית שטוחה, שקופה)	סיגמא-אלדריץ'	קורנינג, 3370
מאגר קורנינג קוסטאר (50 מ"ל)	סיגמא-אלדריץ'	קורנינג, 4870
EPOCH2	ביו-טק	2014-EP2-002 / EPOCH2T
ספסל BIO Clean	פנאסוניק	MCV-B131F
זני חיידקים	ארגון בנק מתוח; הפרויקט הלאומי למשאבים ביולוגיים (NBRP) ביפן