הערכת פעילות צ'פרון חיידקית באמצעות התפתחות תרמית של חלבון מודל

תקציר

מקור: דאל, ג'. ואחרים. זיהוי פעילות התלויה ב-pH של Escherichia coli Chaperone HdeB במבחנה ובחיים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים בדיקה מבוססת ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה להערכת פעילות צ'פרון על חלבון סובסטרט תחת לחץ חומצי וחום. הוא מפרט את השלבים לניטור התפתחות התפתחות והצטבר של המצע באמצעות פיזור אור, תוך השוואת תנאים עם ובלי המלווה (chaperone).

פרוטוקול

1. בדיקת פעילות צ'פרון באמצעות דהידרוגנאז מלאט מתפתח תרמית (MDH)

הערה: השפעת HdeB מטוהר על הצטברות של דהידרוגנאז המטוכונדריאלי של החזיר המתפתח תרמית (MDH) בערכי pH שונים נבדקה כפי שמתואר להלן. כל ריכוזי החלבון הרשומים מתייחסים לריכוז המונומר.

1. להכנת MDH, יש לדיאליזציה של MDH בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה מול 4 ליטר בופר C (50 מ"מ מול פוספט אשלגן, 50 מ"מ מלחין נתרן כלוריד (NaCl), pH 7.5) ולרכז את החלבון לכ-100 מיקרומולר באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות עם חיתוך משקל מולקולרי של 30 קילו-דלטון.
   הערה: נדרשת דיאליזה זהירה של MDH שכן MDH מועבר כתמיסת אמוניום סולפט.
2. להסרת אגרגטים, יש לצנטריפוגה את החלבון למשך 20 דקות ב-20,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. קבעו את ריכוז ה-MDH באמצעות ספיגה ב-280 ננומטר (ε_{280 ננומטר}= 7,950 מ'^-1 ס"מ-1). הכינו 50 מיקרוליטר אליקוות של MDH והקפאו את האליקוטים לאחסון.
3. הניחו קובטה קוורץ של 1 מ"ל בתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה המצויד במחזיקי דגימות ומערבבים מבוקרי טמפרטורה. הגדר את λ_ex/em ל-350 ננומטר.
4. הוסף נפחים מתאימים של בופר D מחומם מראש (43 מעלות צלזיוס) (150 מ"מ מולר פוספט אשלגן, 150 מ"מ מ׳ NaCl) בערכי ה-pH הרצויים (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ו-pH 5.0) לקובטה וקבע את הטמפרטורה במחזיק הקובט ל-43 מעלות צלזיוס. הנפח הכולל הוא 1,000 מיקרוליטר.
5. הוסף 12.5 מיקרומולר HdeB (או לחלופין, אותו נפח של בופר אחסון HdeB עבור בקרת המאגר) לבופר, ואחר כך הוספת 0.5 מיקרומול MDH. התחל לנטר את פיזור האור. דגרו את התגובה למשך 360 שניות כדי לאפשר התפתחות מספקת של MDH.
6. העלה את ה-pH ל-7 על ידי הוספת נפח של 0.16-0.34 של 2 מטר K₂HPO₄ ללא בופר והמשך להקליט פיזור אור למשך עוד 440 שניות.
7. קבע את היקף הצטברות ה-MDH שנרשמה בהיעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (להלן 500 שניות, כאשר נצפתה פיזור האור המרבי של MDH) ל-100%. נרמל את פעילות HdeB לאות פיזור האור של MDH בהיעדר HdeB בכל ערך pH מסומן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דה-הידרוגנאז מלאט (MDH)	רוש	10127914001
פוספט אשלגן (מונובייסיק)	פישר סיינטיפיק	BP362-500
פוספט אשלגן (דיבאסיק)	פישר סיינטיפיק	BP363-1
ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה F-4500	היטאצ'י	FL25
קובטה תא פלואורסצנציה	אנליטיקס הלמה	119004F-10-40
חומצה הידרוכלורית	פישר סיינטיפיק	A144-212
נתרן הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	BP359-500
יחידות מסנן אולטרה צנטריפוגליות של אמיקון 30K	מיליפור	UFC803024
כלוריד נתרן	פישר סיינטיפיק	S271-10
Spectra/Por 1 ממברנת דיאליזה MWCO: 6 kDa	מעבדות ספקטרום	132650
ספקטרופוטומטר Varian Cary 50	אג'ילנט טק