$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. השפעת ביטוי יתר של Chaperone HdeB על הישרדות E. coli תחת לחץ חומצי
הערה: ה-DNA הגנומי של E. coli MG1655 בודד לפי פרוטוקול סטנדרטי.
- הגברת hdeB מ-E. coli MG1655 באמצעות PCR באמצעות פריימרים, hdeB-BamH, I-rev, GGT, GGT, CTG, GGA, TCC, TTA, ATT, CGG, CAA, GTC, ATT ו-hdeB-EcoR, I-fw, GGT, GCC, GAA, TTC, AGG, AGG, CGC, ATG, AAT, ATT, TCA, TCT, CTC CC, C.
- הגדר את תגובת ה-PCR ב-50 מיקרוליטר כך: 10 מיקרוליטר 5x פולימראז, 200 מיקרומום dNTPs, 0.5 מיקרומום פריימר JUD2, 0.5 מיקרומום פריימר JUD5, 150 נגרם DNA גנומי MG1655, 0.5 מיקרוליטר DNA פולימראז, הוספת ddH2O ל-50 מיקרוליטר.
- בצע הגברה של hdeB כך: שלב 1: 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, מחזור אחד; שלב 2: 30 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.
- שכפול שבר PCR שנוצר לאתרי EcoRI ו-BamHI של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות לשכפול אתרי הגבלה. טיהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן. אמת את הפלסמיד המתקבל על ידי ריצוף.
- המרו את הפלסמיד המבטא HdeB או את הבקרה הווקטורית הריקה pBAD18 לזן BB7224 (ΔrpoH) (גנוטיפ: F-, λ-, e14-, [araD139]B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(SmR) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn 10(TcS) suhX401 deoC1 araD+ rpoH::kan+) המשתמש בתאים בעלי יכולת כימית.
הערה: הזן הזה רגיש לטמפרטורה. - לאחר הלם חום של 45 שניות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, יש לדוגר תאים ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. לבצע רצף מושבה בודד של השיבוטים החיוביים ולדגר במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. הכין תרבית לילה ב-50 מ"לLB Amp ומגדל את התאים ב-200 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס.
- מדללים תרביות לילה פי 40 ל-25 מ"ל LB Amp ומגדלים את החיידקים בנוכחות של 0.5% ערבינוז (Ara) ב-30°C ו-200 סל"ד ל-O.D.600nm = 1.0 כדי לעודד ביטוי חלבון HdeB.
- לניסויי היסט pH, השתמשוב-LB Amp+Ara כדי לדלל את התאים ל-O.D.600nm של 0.5 ולהתאים את ערכי ה-pH המתאימים (כאן: pH 2.0, pH 3.0 ו-pH 4.0) על ידי הוספת נפחים מתאימים של 5 M HCl.
- לאחר נקודות הזמן המצוינות (pH 2, 1 דקה; pH 3, 2.5 דקות; pH 4, 30 דקות), נטרל את התרביות על ידי הוספת נפחים מתאימים של 5 M NaOH.
- יש לעקוב אחר גדילה של התרביות המנוטרלות בתרבות נוזלית למשך 12 שעות בטמפרטורה של 30°C באמצעות מדידות O.D.