חילוץ DNA גנומי מבוסס ניתוק תרמי מחיידק פתוגני

תקציר

מקור: גולה, ס. ואחרים. ניתוח חוזר של מספר משתנה רב-לוקוס של החיידק הפתוגני לדג Yersinia ruckeri באמצעות Multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית. J. Vis. Exp. (2019).

פרוטוקול זה מחלץ DNA גנומי מ-Yersinia ruckeri על ידי השעיית מושבות מבודדות במים אולטרה-טהורים ויישום חום ללירוק התאים. צנטריפוגציה מפרידה בין הסופרנטנט המכיל DNA לפסולת תאים, ומניבה תבנית DNA המתאימה לגנוטיפינג וניתוח אפידמיולוגי מבוסס PCR.

פרוטוקול

1. גידול וחילוץ חיידקים של DNA גנומי

1. זרעו תרביות טהורות של Y. ruckeri על כל סוג אגר מתאים (המחברים השתמשו ב-5% אגר דם בקר) ודגרו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים, או ב-15 מעלות צלזיוס למשך 3-4 ימים.
2. מכל לוח אגר, בחרו מושבה מייצגת אחת עם לולאת חיסון והעבירו לצינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכילות 50 מיקרוליטר מים אולטרה-מטהורים. תשעה, מערבולת לזמן קצר, ודגרה במשך 7 דקות על בלוק חימום בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 3 דקות ומשתמשים בפיפטה כדי להעביר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה ריק בנפח 1.5 מ"ל. המשיכו לשלב הבא תוך שימוש בסופרנטנט כתבנית DNA או אחסון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד אז.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חממה של 22°C/15°C	לפי העדפות.	נה
צנטריפוגות(ות)	לפי העדפות.	נה
צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף, 1.5 מ"ל	אפנדורף	30120086	צינורות צנטריפוגה המשמשים במהלך חילוץ DNA.
מקפיא	לפי העדפות.	נה
בלוק חימום	לפי העדפות.	נה
מי מילי-קיו	נה	נה	מים מטוהרים המשמשים במהלך PCR ואלקטרופורזה קפילרית. מתכון סטנדרטי; הופק בתוך החברה.
התרבות הטהורה של ירסיניה רוקרי	נה	נה	למשל, קריופרשמור או טרי.
וורטקסר	לפי העדפות.	נה