זיהוי פתוגנים לדגים באמצעות ניתוח חוזרות משתנה (VNTR)

Abstract

מקור: גולה, ס. ואחרים. ניתוח חוזר של מספר משתנה רב-לוקוס של החיידק הפתוגני לדג Yersinia ruckeri באמצעות Multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון הזה מדגים את ההליך להפרדת אמפליקונים חוזרים עם מספר משתנה (VNTR) המתויגים פלואורסצנטית, שמקורם בחיידק פתוגני לדגים, תוך שימוש באלקטרופורזה קפילרית ליצירת פרופילי אלקטרופרוגרמה ספציפיים לגודל לזיהוי חיידקים.

Protocol

1. הגדרת אלקטרופורזה קפילרית ותנאי הפעלה

1. לאחר אישור אמפליקונים של PCR (תגובת שרשרת פולימראז), דילל מוצרי PCR ביחס 1:10 (v/v) במים מטוהרים. אטום, ערבב וצנטריפוגה לזמן קצר.
2. בעבודה בארון אדים, הכינו נפח של תערובת מאסטר הכוללת 9 מיקרוליטר פורמיד ו-0.5 מיקרוליטר בגודל סטנדרטי לכל מוצר PCR (מאפשר עודף של 10%). מערבולת לזמן קצר ומפזר 9.5 מיקרוליטר לבארות על לוח מתאים למערכת CE (אלקטרופורזה קפילרית) הזמינה, לפני הוספת 0.5 מיקרוליטר של מוצר PCR מדולל. אטום, ערבב וצנטריפוגה לזמן קצר.
   זהירות: תטפל בזהירות. ערבוב פורמיד עם מים מייצר חומצה פורמית, שהיא רעילה.
3. באמצעות מחזור תרמי PCR, יש לבצע דניטורציה של הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לפני הקירור ל-4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה לזמן קצר וטעין את הפלטה על מערכת CE מכויילת לפי הוראות היצרן.
4. הרץ ניתוח מקטעים CE באמצעות מגיבים בהתאם למכשיר המועדף ולהגדרות הבאות: 60°C; הזרקות של 5 שניות ב-1.6 קילווולט (32 וולט לס"מ); זמן ריצה של 32 דקות ב-15 קילו-וולט (300 וולט לס"מ). ניתוח קטעי CE של 24 בארות על 24 נימים (50 ס"מ) ייקח בדרך כלל כ-50 דקות.

Materials