זיהוי פתוגנים לדגים באמצעות ניתוח חוזרות משתנה (VNTR)

תקציר

מקור: גולה, ס. ואחרים. ניתוח חוזר של מספר משתנה רב-לוקוס של החיידק הפתוגני לדג Yersinia ruckeri באמצעות Multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון הזה מדגים את ההליך להפרדת אמפליקונים חוזרים עם מספר משתנה (VNTR) המתויגים פלואורסצנטית, שמקורם בחיידק פתוגני לדגים, תוך שימוש באלקטרופורזה קפילרית ליצירת פרופילי אלקטרופרוגרמה ספציפיים לגודל לזיהוי חיידקים.

פרוטוקול

1. הגדרת אלקטרופורזה קפילרית ותנאי הפעלה

1. לאחר אישור אמפליקונים של PCR (תגובת שרשרת פולימראז), דילל מוצרי PCR ביחס 1:10 (v/v) במים מטוהרים. אטום, ערבב וצנטריפוגה לזמן קצר.
2. בעבודה בארון אדים, הכינו נפח של תערובת מאסטר הכוללת 9 מיקרוליטר פורמיד ו-0.5 מיקרוליטר בגודל סטנדרטי לכל מוצר PCR (מאפשר עודף של 10%). מערבולת לזמן קצר ומפזר 9.5 מיקרוליטר לבארות על לוח מתאים למערכת CE (אלקטרופורזה קפילרית) הזמינה, לפני הוספת 0.5 מיקרוליטר של מוצר PCR מדולל. אטום, ערבב וצנטריפוגה לזמן קצר.
   זהירות: תטפל בזהירות. ערבוב פורמיד עם מים מייצר חומצה פורמית, שהיא רעילה.
3. באמצעות מחזור תרמי PCR, יש לבצע דניטורציה של הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לפני הקירור ל-4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה לזמן קצר וטעין את הפלטה על מערכת CE מכויילת לפי הוראות היצרן.
4. הרץ ניתוח מקטעים CE באמצעות מגיבים בהתאם למכשיר המועדף ולהגדרות הבאות: 60°C; הזרקות של 5 שניות ב-1.6 קילווולט (32 וולט לס"מ); זמן ריצה של 32 דקות ב-15 קילו-וולט (300 וולט לס"מ). ניתוח קטעי CE של 24 בארות על 24 נימים (50 ס"מ) ייקח בדרך כלל כ-50 דקות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנלייזר גנטי Avant 3500xL	תרמו פישר סיינטיפיק	A30469	משמש לניתוח קטעי אלקטרופורזה קפילרית.
מודולי BioNumerics7	מתמטיקה שימושית	נה	משמש ליצירת עצי מרחבים מינימליים מנתוני MLVA.
צנטריפוגות(ות)	לפי העדפות.	נה
צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף, 1.5 מ"ל	אפנדורף	30120086	צינורות צנטריפוגה המשמשים במהלך חילוץ DNA.
מקפיא	לפי העדפות.	נה
ארון אדים	לפי העדפות.	נה
תוכנת GeneMapper 5	תרמו פישר סיינטיפיק	4475073	משמש לקריאת אלקטרופרוגרמות מאלקטרופורזה קפילרית.
גודל צבע GeneScan 600 LIZ Standard v2.0	תרמו פישר סיינטיפיק	4408399	תקן הגודל המשמש במהלך אלקטרופורזה קפילרית.
הי-די פורמיד	תרמו פישר סיינטיפיק	4311320/4440753	פורמיד דה-יוני המשמש במהלך אלקטרופורזה קפילרית. הכן את החומרים הפעילים.
מי מילי-קיו	נה	נה	מים מטוהרים המשמשים במהלך PCR ואלקטרופורזה קפילרית. מתכון סטנדרטי; הופק בתוך החברה.
ערכת Multiplex PCR Plus	קיאגן	206151/206152
מחזור תרמי PCR	לפי העדפות.	נה
פולימר POP-7 לאנלייזרים גנטיים 3500 Dx/3500xL Dx	תרמו פישר סיינטיפיק	A26077/4393713/4393709	מטריצת הפרדה המשמשת במהלך אלקטרופורזה קפילרית.
תרבות טהורה Yersinia ruckeri	נה	נה	למשל, קריופרשמור או טרי.
מים ללא RNase	קיאגן	נה	ב: ערכת Multiplex PCR Plus
בופר Tris-borate-EDTA (TBE)	נה	נה	מתכון סטנדרטי; הופק בתוך החברה.
אגר סויה טריפסין/אגר דם בקר	נה	נה	מתכון סטנדרטי; הופק בתוך החברה.
וורטקסר	לפי העדפות.	נה