פרוטוקול זה מחלץ DNA גנומי מ-Yersinia ruckeri על ידי השעיית מושבות מבודדות במים אולטרה-טהורים ויישום חום ללירוק התאים. צנטריפוגציה מפרידה בין הסופרנטנט המכיל DNA לפסולת תאים, ומניבה תבנית DNA המתאימה לגנוטיפינג וניתוח אפידמיולוגי מבוסס PCR.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפקת DNA גנומי מרקמת עלי צמח שנדבקה בחיידקים פתוגניים
644 צפיות
⸱
28 בנובמבר 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. גידול וחילוץ חיידקים של DNA גנומי
- זרעו תרביות טהורות של Y. ruckeri על כל סוג אגר מתאים (המחברים השתמשו ב-5% אגר דם בקר) ודגרו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים, או ב-15 מעלות צלזיוס למשך 3-4 ימים.
- מכל לוח אגר, בחרו מושבה מייצגת אחת עם לולאת חיסון והעבירו לצינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכילות 50 מיקרוליטר מים אולטרה-מטהורים. תשעה, מערבולת לזמן קצר, ודגרה במשך 7 דקות על בלוק חימום בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 3 דקות ומשתמשים בפיפטה כדי להעביר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה ריק בנפח 1.5 מ"ל. המשיכו לשלב הבא תוך שימוש בסופרנטנט כתבנית DNA או אחסון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד אז.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת טיהור DNA גנומי של Wizard | פרומגה | A1120 | מקור לפירוק גרעינים, RNase, משקעי חלבונים ותמיסות החזרת DNA |
| חנקן נוזלי | מוצרי אוויר | לא זמין | |
| Mastercycler Pro עם לוח בקרה | אפנדורף | 6321000019 | |
| מיקרוגל 1250 וואט | פנאסוניק | לא זמין | |
| צנטריפוגה שולחנית 5424 | אפנדורף | 05-403-93 | |
| אמבט מים דיגיטלי Isotemp 215 | פישר סיינטי | 15-462-15Q | |
| מרית מתכת | סיגמא-אלדריץ' | Z283274 | |
| מרגמה ועלי | סיגמא-אלדריץ' | Z247464 | |
| מערבל מערבולת LSE | קורנינג | 6775 | |
| 2-פרופנול | סיגמא-אלדריץ' | I9516 | |
| קצות סטריליים בנפח 10 מיקרוליטר | טיפ-וואן | 1161-3730 | |
| קצות סטריליים בנפח 200 מיקרוליטר | טיפ-וואן | 1163-1730 | |
| קצות סטריליים בנפח 1250 מיקרוליטר | טיפ-וואן | 1161-1750 | |
| ערכת פיפטור בנפח משתנה | VWR | 75788-460 | |
| אתידיום ברומיד | סיגמא-אלדריץ' | E1510 | |
| אגרוז | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | תרמו פישר סיינטיפיק | 17892 | |
| חומצה אצטית | פישר כימיקל | A38-212 | |
| בסיס טריס | סיגמא-אלדריץ' | 10708976001 | |
| μcuvette | אפנדורף | 6138000018 | |
| בסיס ביוספקטרומטר | אפנדורף | 6135000009 |
