מבחן שכבת אגר רכה לזיהוי הרג בתיווך בקטריוצין ב-Pseudomonas syringae

תקציר

מקור: Hockett, K. L., ו-Baltrus, D. A. שימוש בטכניקת שכבת האגר הרכה לסינון תרכובות מעכבות שנוצרות על ידי חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון הזה מדגים את ההליך לזיהוי הריגה מתווכת בקטריוצין על ידי זיהוי סופרנטנט מזן תורם שנגרם על ידי אנטיביוטיקה על שכבת אגר רכה המכילה זן בדיקה. אזורים נקיים שנוצרים לאחר הדגירה מעידים על עיכוב חיידקים.

פרוטוקול

1. הכנת שכבה ובדיקת סופרנטנטים לפעילות

1. החרינו מושבה אחת של זן P. syringae לבדיקה לרגישות ב-3 מ"ל של KB (מדיום King's B), והדגרו למשך הלילה עם ניעור בטמפרטורת החדר.
2. למחרת בבוקר, תדלל את התרבות 1/100 ל-KB טרי. דגרו 3-4 שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר.
3. הכינו אגר מים סטריליזי על ידי אוטוקלבינג של 0.35-0.7% אגר (w/v) במים אולטרה-טהורים.
   הערה: ציר אגר מים רכים ניתן להמיס במיקרוגל ולהשתמש בו שוב ושוב; אין צורך להכין שכבה חדשה לכל ניסוי. אם אגר מים משומש שוב, חשוב לוודא שהוא נמס לחלוטין לאחר המיקרוגל. אם לא, השכבה תהיה בעלת מרקם גרעיני כשהיא מתגבשת, מה שיקשה על הפרשנות.
4. לפני השימוש, שמרו את האגר הרך והמותך באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, יש להעביר 3 מ"ל אגר רך לצינור תרבית סטרילי. החזירו את צינור הגידול לאמבט המים כדי לשמור על מצב מותך.
5. כדי לשפוך את השכבה, תחילה תן לאגר המותך להתקרר (הוא אמור להרגיש חם אך לא חם למגע), אך אל תתן לו להתקשות.
6. במכסה סטרילי, הזרקו 100 מיקרול מתרבות הבודק לאגר הרך ולמערבובת כדי לערבב. סובב תרבית ידנית במשך 10-15 שניות, ואז שפוך על אגר תחתון (אגר KB). הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי לוודא שהאגר הרך מכסה באופן שווה את האגר התחתון.
   הערה: האגר התחתון יכול להיות כל מדיום מוצק (1.5% אגר) שבו הזן הניסיוני גדל במהירות. לצלחת פטרי סטנדרטית בקוטר 100 מ"מ, השתמשו ב~20 מ"ל של מדיום מותך. ניתן להכין את האגר התחתון מספר שבועות מראש (אם שומרים על 4 מעלות צלזיוס ללא ייבוש) או להכין אותו באותו יום.
7. כסו את הצלחת ותנו לה להתגבש במשך 20-30 דקות. היזהר לא להפריע ללוח בזמן שהוא מתקשה.
8. לאחר ההתגבשות, יש להניח 2-5 מיקרוליטר של סופרנטנט על השכבה. תן לצלחות לדוג כל הלילה בטמפרטורת החדר. צפו ורשמו תוצאות בבוקר שלמחרת.
   הערה: ייתכן שיהיה מועיל לבצע ולזהות מהדילול הסדרתי של הסופרנטנט. דבר זה יאפשר לחוקרים להבחין בין פעילות ניקוי בקטריאוצינים לבין פעילות ניקוי בקטריוצין. במקרה זה, מומלץ לבצע דילול של 1:5 או 1:10.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיטומיצין C	ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז	SC-3514	סרטן. השתמשו בציוד מגן מתאים (כפפות, מגן עיניים ומסכת פנים), במיוחד בעת הכנת התמיסה המקורית.
אגר בדרגת בקטריולוגיה	ג'נסי סיינטיפיק	20-274