בידוד חיידקים מותאמים ללחץ באמצעות סלקציה של מושבה בודדת

תקציר

מקור: ג'ונג, ה., ואחרים. הליך לאבולוציה מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים באמצעות כימוסטט. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון הזה מדגים את הבידוד והגדילה הסלקטיביים של חיידקים המותאמים ללחץ מתרבות שנחשפו לתנאי לחץ ממושכים. התרבית מצופה על אגר המכיל מלחץ, ומושבה אחת נבחרת להחסן מדיום נוזלי בגורם הלחץ. הספיגה נמדדת במרווחים קבועים כדי לעקוב אחר הצמיחה ולאשר את הבידוד המוצלח של החיידקים המותאמים ללחץ.

פרוטוקול

1. הכנת ציוד

1. קבל צנצנת כימוסטה (150-250 מ"ל) או בקבוק ארלנמאייר (250 מ"ל) עם פתח כניסה ויציאה. חבר את היציאות עם צינורות סיליקון, מה שמאפשר קצב זרימה של 10-100 מ"ל לשעה. באופן אופציונלי, יש להשתמש בפתח אוורור, יציאת אוויר, ויציאות יציאה וכניסה מבוקרות טמפרטורה.
2. רכשו מכשיר מתאים לצנצנת הכמוסטה שמאפשר ערבוב ושליטה בטמפרטורה (או השתמשו באינקובטור ניעור סיבובי).
3. קנה שתי משאבות פריסטלטיות כדי לספק מדיום טרי ולאסוף את התרבית.
4. קבל צנצנת מאגר (10-20 ליטר) עם פתח יציאה בינוני ופתח כניסת אוויר.
5. השגת צינור סיליקון המתאים לקצב הדילול (כלומר, מזהה 0.8 מ"מ, טווח זרימה 0.06-36 מ"ל לדקה; צינור L/S 13).

2. הכנה בינוניים ועיקור

1. מדיום התחלתי
   1. המיס 0.3 גרם גלוקוז, 0.08 גרם כלוריד אמוניום (NH₄Cl), 0.05 גרם נתרן כלוריד (NaCl), 0.75 גרם די-נתרן מימן פוספט דיהידרט (Na₂HPO₄·2H₂O), ו-0.3 גרם די-נתרן מימן פוספט דיהידרט (KH₂PO₄) במים מזוקקים בנפח 90 מ"ל (D.W.) בצנצנת כימוסטט.
   2. אטום את צנצנת הכמוסטט יחד עם הצינור באמצעות מהדקים. אל תאטום את פתח האוורור.
   3. חטא את צנצנת הכמוסטאט באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר העיקור, שמרו את צנצנת הכמוסטאט בטמפרטורת החדר.
   4. המיס 0.02 גרם מגנזיום סולפט הפטהידרט (MgSO_{4.7H 2}O), 0.01 גרם סידן כלורי (CaCl₂), ו-0.1 מ"ג תיאמין ב-10 מ"ל D.W. (תמיסה A).
   5. תמיסת סינון A באמצעות מזרק ומסנן מזרק מחוטא מראש (פילטר נקבובית 0.45 מיקרון).
   6. הוסף את הסינון של התמיסה A לצנצנת הכמוסטט.
2. מדיום לחץ
   1. המיס 30 גרם גלוקוז, 8 גרם NH₄Cl, 5 גרם NaCl, 75 גרם Na₂HPO₄·2H₂O, 30 גרם KH₂PO₄, ו-300 גרם די-סודיום סוקסינאט הקסיהידרט (Na₂·succinate·6H₂O; המתח ששימש בניסוי זה) ב-9.9 L D.W. בצנצנת מאגר.
   2. סגור את צנצנת המאגר יחד עם הצינור באמצעות מהדקים. אל תאטום את פתח האוורור.
   3. חטא את צנצנת המאגר באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר החיטוי, שמרו את הצנצנת בטמפרטורת החדר.
   4. המיס 2 גרם MgSO_{4.7H 2}O, 1 גרם CaCl₂, ו-10 מ"ג תיאמין ב-100 מ"ל D.W. (תמיסה A).
   5. תמיסת סינון A עם מזרק ומסנן מזרק מחוטא מראש (פילטר נקבוביות 0.45 מיקרון).
   6. הוסף את הסינון של התמיסה A לצנצנת המאגר.
   7. חבר אספטית את צינור הסיליקון המעוטר לצנצנת המאגר וחבר את המשאבות הפריסטלטיות.
3. מדיום לחץ גבוה
   1. הכינו את המדיום כפי שהיה בסעיף 2.2, אך עם ריכוז גבוה יותר של גורם לחץ (כלומר, 3-5 גרם לליטר גבוה יותר בהתאמה הסוקסינטית).
      הערה: פרוטוקול זה מיועד להתאמה לעומס שניתן להעביר דרך המדיום. במקרה של לחצים פיזיים כמו טמפרטורה, ערבוב או תאורה, יש לעצב את הגידול בהתאם.

3. גידול ראשוני

1. החרינו מושבה אחת של Escherichia coli מסוג בר (E. coli) במבחנה בנפח 15 מ"ל המכילה 4 מ"ל מדיום התחלתי.
2. דגרו את המבחנה באינקובטור ניעור למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד.
3. העבר אספטית 1 מ"ל של פרה-קולטור לצנצנת הכמוסטט.
4. דגרו את צנצנת הכמוסטט, תוך מתן אוורור (אוויר 50 מ"ל לדקה) וערבוב (200 סל"ד), בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.

4. הסתגלות ללחץ

1. חבר אספטית את קצה צינור הסיליקון מהמשאבות לצנצנת הכמוסטט.
2. הפעל את משאבת היציאה (10 מ"ל לשעה ומעלה) ואסף תרבית. הערה: התרבית צריכה להיות בשלב האקספוננציאלי, בדרך כלל 4-8 שעות לאחר הגידול הראשוני.
3. בדוק את הצפיפות האופטית (600 ננומטר) של התרבית מצינור היציאה.
4. הפעל את משאבת הכניסה (10 מ"ל לשעה, בהתאם לקצב דילול של 0.1 שעה-1).
5. בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר מצינור היציאה כל 24 שעות.
6. להפעיל את הכמוסטאט במשך 96 שעות (מחזור פי 9.6) או יותר. אם הצפיפות האופטית יציבה, החליפו את המאגר המכיל את המדיום בעל המתח הגבוה. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ-0.2, עצרו את משאבת הכניסה ל-6 שעות. הפעל מחדש את משאבת הכניסה ובדוק שהצפיפות האופטית מעל 0.2.
7. הגדילו בהדרגה את ריכוז המתח על ידי מעבר למאגר המכיל ריכוז מתח גבוה יותר.
8. קחו דגימות מהתרבית המותאמת כאשר היא מגיעה לאבן דרך (למשל, זן מותאם למאמץ סוקסינאט של 100 גרם/ליטר), ואחסנו אותן לניתוח גנומי נוסף.
9. לאחסון דגימה, מערבבים את דגימת התרבית (0.5 מ"ל) עם תמיסת גליצרול 80% מעוקרת (0.5 מ"ל) ואחסנו אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הערה: אם המיקרואורגניזם רוכש יכולת לפרק את הגורם במהלך תהליך ה-AL, ריכוז הלחץ בצנצנת התסיסה אינו זהה לזה שבמאגר הטרי.

5. בידוד מושבה בודדת של הזן המותאם למתח

1. הכינו פלטת אגר מדיום (1.6% אגר) המכיל את אותו גורם לחץ ובאותו ריכוז של מדיום.
2. הצלח את תרבית היציאה (0.1 מ"ל) מהכימוסטט, ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
3. קטף מושבות בודדות מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי וחסן אותן במבחנות של 15 מ"ל המכילות את אותו גורם לחץ ובריכוז בינוני כמו בכימוסטט, ודגר במשך 6 שעות.
4. העבר 1 מ"ל מרק תרבית לבקבוק Erlenmeyer בנפח 250 מ"ל שמכיל 50 מ"ל מדיום. קצור 0.5 מ"ל ממרק התרבית כל שעה, ומדוד את המינון ב-600 ננומטר. השוו את קצב הגדילה של הזן המותאם לזה של הזן הפראי בהתחשב בגורם הלחץ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תסיסת מיני-כימוסטט	ביוטרון בע"מ.	-	יוצר בהזמנה מיוחדת
צינורות סיליקון	קול-פרמר	מאסטרפלקס L/S 13	גודל הצינור יכול להשתנות בהתאם לקצב הדילול ולגודל צנצנת התסיסה.
צנצנת מאגר	בלקו	בקבוק אחסון מדיה	20 ליטר
כימיקלים	סיגמא-אלדריץ'	-	דרגת ריאגנט
גלוקוז	סיגמא-אלדריץ'	G5767	תגובת ACS
NH₄Cl	סיגמא-אלדריץ'	A9434	לביולוגיה מולקולרית, מתאים לתרבות תאים, ≥99.5%
NaCl	סיגמא-אלדריץ'	746398	תגובת ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	סיגמא-אלדריץ'	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	סיגמא-אלדריץ'	795488	תגובת ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	סיגמא-אלדריץ'	230391	תגובת ACS, ≥98%
CaCl₂	סיגמא-אלדריץ'	793639	תגובת ACS, ≥96%
תיאמין·HCl	סיגמא-אלדריץ'	T4625	דרגת ריאגנט, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	סיגמא-אלדריץ'	S2378	ReagentPlus, ≥99%