1. איסוף ואחסון מים ואלמוגים לבידוד מיקרוביאלי
הערה: חשוב לקחת את הקואורדינטות והטמפרטורה של אתרי הדגימה. אם אפשר, מטא-נתונים כמו מליחות, pH, עומק ועוצמת אור יכולים גם הם לסייע במציאת גישות טיפוח מכוונות ופרשנות עתידית של נתונים. לתוצאות אמינות, שמרו את הדגימות מאוחסנות למשך הזמן המינימלי האפשרי. המיקרוביום של מים/אלמוגים עשוי להשתנות משמעותית אם הדגימות לא נשמרות בטמפרטורה הנכונה ו/או נשמרות לפרקי זמן ארוכים. אם שלב הבידוד לא מתבצע מיד לאחר האיסוף, חשוב לשמור על דגימות בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד. ככל שהדגימות נשמרות זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כך הקהילה המיקרוביאלית תשתנה.
- לדגום ולאחסן את מי הים.
- אסוף דגימות מים של 500 מ"ל לפחות בשלוש עותקים מכל אתר דגימה ממוקדת. עדיף להשתמש בבקבוקים סטריליים עם פקקי ברגים.
- אם מעבדים את המים מיד אחרי האיסוף, השאר את הבקבוקים ב-RT לפרק זמן קצר. אם עיבוד הדגימה מתבצע מאוחר יותר, שמור על הבקבוקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- דגמו ואחסנו את האלמוגים.
- השתמש בזוג פליירים סטריליים כדי לחתוך שברי אלמוגים מאותו אתר דגימה של דגימות המים. כדי למנוע זיהום, נגעו באלמוגים רק עם כפפות סטריליות.
- שטוף את שבר האלמוגים שנדגם באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 20 מ"ל (3% NaCl במים מזוקקים) או מי ים מלאכותיים כדי להיפטר מהחיידקים החופשיים המחוברים ברפיון של מי הים.
- באמצעות מלקחיים, מניחים כל שבר אלמוג במיכל סטרילי בנפח 250−500 מ"ל עם מכסה בורג המכיל תמיסת מלח סטרילית.
- במעבדה, באמצעות מלקחיים סטריליים ופליירים, שוקלים 5 גרם של שברי אלמוגים באמצעות צלחות פטרי סטריליות בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על משקל שקילה.
- העבר את 5 גרם דגימת האלמוגים למכתש סטרילי ומרסר אותו באמצעות עלי סטרילי.
- באמצעות מרית סטרילית, העבר את הדגימה המרוסנת לבקבוק תרבית סטרילי המכיל 45 מ"ל של תמיסת NaCl סטרילית של 3% ו-10−15 חרוזי זכוכית של 5 מ"מ. השתמשו בתמיסת מלח סטרילית של 45 מ"ל כדי לשטוף את המלט ולהחזיר את הכמות המקסימלית של המצראט.
- שמור על הבקבוקים תחת ערבוב קבוע (150 x גרם) במשך 16 שעות בטמפרטורת המים של אתר הדגימה.
הערה: עבור אלמוגים במים רדודים, הטמפרטורה האופטימלית תעה בין 24−28 מעלות צלזיוס. שלב זה יפריד מיקרואורגניזמים מתאי אלמוגים שונים, כגון אלה שמחוברים לתאי המארח, או אלה החיים בתוך הרקמה והשלד. לאחר שלב זה, אין לאחסן את המצרטים האלמוגיים, ושלב הבידוד חייב להתבצע מיד.
2. בידוד חיידקים מפירוקי אסטרוגן סינתטי 17a-אתינילאסטרדיול (EE2) ממי ים ו/או אלמוגים
- בחר חיידקים.
הערה: לאחר שלבים 1.1.2 ו-1.2.7, ריכוז המיקרואורגניזמים במי הים שהתנתקו מהמקרטים האלמוגים השונים יהיה לא ידוע ומשתנה. כדי להבטיח בידוד של מושבות מיקרוביאלית בודדות בצלחות פטרי המכילות מדיום אגר, יש צורך בדילול סדרתיים.- בצע דילול סדרתי עד 10-9 בתמיסת מלח סטרילית לדגימות אלמוגים ועד 10-6 לדגימות מים. פיפט מדלל פי 5 למעלה ולמטה לפני שמשליכים את הקצה. דגימת Vortex במשך 5 שניות בכל פעם לפני ביצוע הדילול הסדרתי הבא.
- פיפט 100 מיקרולטר מכל דילול על צלחות פטרי המכילות 3% NaCl lysogeny broth (LB) אגר מדיום, ומניחים אותם בצלחת.
הערה: השתמש באגר ימי (MA) כמדיום חלופי. נדרשות שלוש עותקים של כל דילול לתוצאות אמינות. - דגרו את הלוחות למשך 1−3 ימים בטמפרטורת היעד (למשל, 26 מעלות צלזיוס). בדוק את הלוחיות פעם ביום.
- בחר ובודד את המושבות המציגות מורפולוגיות גדילה מובחנות על לוחות חדשים באמצעות טכניקת לוחות הפסים. חזור על השלב הזה כמה פעמים שצריך כדי לגדול מושבות טהורות על הלוחות.
- אם ההליך לא ממשיך מיד לשלב 2.3.1, יש לאחסן את הבידוד בטמפרטורה של 4°C או בגליצרול כפי שמתואר בסעיף 2.2.
- הכינו מלאי גליצרול.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי וניתן להשתמש בו לאחסון מאגרי חיידקים לטווח ארוך.- בחר מושבות בודדות מהפלטה הטרייה או מהלוחות המאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והחסן אותן באופן עצמאי ב-2 מ"ל של מדיום LB סטרילי.
- הנח צינורות תחת ערבוב קבוע (150 x גרם) בטמפרטורה של 24−28 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (ON).
- הוסיפו 1 מ"ל מהתרביות החיידקיים משלב 2.2.2 וגליצרול סטרילי לריכוז סופי של 20% ל-2 מ"ל הקריוביאלים.
- השאירו את הקריוביאלים דלוקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הניחו את מלאי החיידקים של הגליצרול בטמפרטורה של -80°C עד שצריך.
- בצע את מבחן היכולת של EE2-Degradation.
- הפעילו את הבודדים במרק LB או במדיה חלופית. לשם כך, בחרו מושבה אחת מהלוחות הטריים או מהצלחת המאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והחרינו 2 מ"ל מדיום LB סטרילי. במקרה שמדובר במלאי גליצרול, תחילה מרח אותו על לוחות אגר LB ודוגר בטמפרטורה של 24−28 מעלות צלזיוס כדי לגדול מושבות בודדות. הניחו את הצינור המכיל מדיום LB בנטייה תחת ערבוב קבוע (150 x גרם) בטמפרטורה של 24−28 מעלות צלזיוס (ON).
- לאחר צמיחת חיידקים, יש לפרום את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 x גרם למשך 8 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט ובצנרת עדינה למעלה ולמטה, החזירו את התאים בנפח שווה (2 מ"ל) של מים מלוחים כדי לשטוף את מרק ה-LB שנותר.
- חזור על שלב 2.3.2 פעמיים כדי להבטיח שאין עקבות למקור פחמן, ולהחזיר את התאים בנפח שווה של תמיסת מלח. לדוגמה, אם התחילו בתרבית של 2 מ"ל, החזירו את התאים בנפח סופי של תמיסת מלח של 2 מ"ל.
- החרינו את התאים השטופים והמושבים במדיום תרבית מינימלי של בושנל האס (BH Broth) המכיל EE2 כמקור הפחמן היחיד.
הערה: EE2 מומס באתנול בריכוז סופי של 5 מ"ג/ליטר בתווך התרבית. בצע שינויים בסוג הזיהום ו/או בריכוז במידת הצורך. - הערכה של גדילה חיידקית לפי צפיפות אופטית ב-600 ננומטר ו/או יחידות יוצרות מושבות (CFU) על מדיום אגר LB, למשך 16−72 שעות של דגירה.
הערה: לחילופין, ניתן לבודד את המיקרואורגניזמים ישירות על מדיום מינימלי המכיל EE2 או תרכובות אחרות כמקור הפחמן היחיד. שלב זה יכוון את הבחירה וימנע צמיחה לא רצויה.